黄芪甲苷调控线粒体自噬减轻5−Fu诱导老龄大鼠心肌毒性的实验研究

李沅洋 ，周湘忠，雷向红，张宇凡 ，徐月，魏丽萍

5−氟尿嘧啶（5−fluorouocil，5−Fu）是抗代谢类化疗药物，临床应用广泛，尤其对于无法耐受手术需药物化疗的老龄患者意义重大。然而，5−Fu发挥抗肿瘤效应的同时存在多器官不良反应，其中肿瘤相关心血管疾病报道尤为多见［1−2］。5−Fu 用于老龄尤其是伴有心血管基础疾病的患者时心脏毒性发生率更高，程度更重［3］。因此，应重视化疗药物心脏毒性的防治。黄芪甲苷（Astragaloside Ⅳ，AS−Ⅳ）是黄芪的主要活性成分，可通过清除氧自由基、抗脂质过氧化等途径参与心肌细胞的保护［4］。本研究拟在老龄鼠模型中评价AS−Ⅳ对5−Fu 诱导心肌毒性的保护作用，从调控线粒体自噬稳态角度初探其分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 18月龄（老龄）雄性SD大鼠36只，平均体质量（600±50）g，购自北京维通利华实验动物技术公司，动物许可证号：SCXK（京）2019−0006。将大鼠依次编号，应用随机数字表法进行分组，分为对照组、模型组和AS−Ⅳ组，每组12只。所有大鼠饲养于天津市人民医院恒温动物实验中心，自由进食水。经预实验后以5−Fu 注射液30 mg/kg，隔日1 次，腹腔注射，连续7 次，构建5−Fu 心脏毒性模型，对照组等方式等剂量给与0.9%氯化钠注射液；AS−Ⅳ组在造模基础上以AS−Ⅳ稀释液20 mg/kg，每日 1 次，灌胃，连续 14 次。本实验经天津市人民医院伦理委员会批准（2020−B03）。

1.2 主要仪器和试剂 氟尿嘧啶注射液（20 mg/支，天津金耀氨基酸有限公司，批准文号H12020959），大鼠血清心肌肌钙蛋白I（cTnI）及肌酸激酶同工酶（CK−MB）酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（武汉Elabscience 有限公司），线粒体腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）及膜电位检测试剂盒（上海碧云天有限公司），兔源LC3Ⅱ一抗（美国Proteintech Group公司），Beclin1、Parkin、PINK1、LAMP、COX−Ⅳ一抗（沈阳万类生物有限公司），LC3 一抗及辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗IgG（美国Cell Signaling Technology 公司）。多功能酶标仪（美国Bio−Rad 公司），光学显微镜、荧光显微镜（日本Nikon公司），透射电镜（日本日立公司），凝胶成像分析系统（美国Bio−Rad公司）。AS−Ⅳ购自Med Chem Express，纯度为98.0%，实验药物用量参照产品在体实验推荐剂量。按照大鼠总用量取AS−Ⅳ粉剂，溶于10% DMSO 中配制为20 mmol/L 母液于−4 ℃保存，用时取出适量母液在超声助溶下以0.9%氯化钠注射液稀释成10 mmol/L。

1.3 实验方法

1.3.1 大鼠一般情况观察 各组大鼠自给药前1 d起至第15天，连续监测体质量，依据体质量给予相应剂量药物，最终以给药第0、3、6、9、12、15天体质量值作为统计数据。同时观察给药期间各组大鼠毛色、精神状态、纳食、二便等情况。于实验第15天处死取材。至实验结束，模型组死亡3只，AS−Ⅳ组死亡1只。

1.3.2 血清cTnI 及CK−MB 检测 腹主动脉取血，室温静置30 min，离心（4 ℃，1 000×g，15 min），收集血清。每组取6只，采用ELISA 法检测大鼠血清CK−MB、cTnI 含量。酶标仪在450 nm波长处测量光密度（OD）值，绘制标准曲线，计算样本指标含量。

1.3.3 线粒体ATP 检测 取新鲜心肌组织20 mg，加入裂解液，匀浆低温离心（4 ℃，12 000×g，5 min）取上清，将ATP标准溶液稀释成不同浓度制备标准曲线，配制ATP 检测工作液，将100 μL ATP 检测工作液加入不透光96 孔板内，室温静置5 min 消除ATP 本底后加入待检样品，采用化学发光仪（luminometer）测定RLU 值。取少量上清用BCA 法检测蛋白浓度，最终ATP值需转换为μmol/g蛋白形式进行定量。该指标需以新鲜组织、低温环境下提取线粒体，以保证细胞存活及线粒体呼吸代谢相关酶的活性，对时间效率要求较高。因此实验中调整样本量（n=5），达到取材与线粒体提取同时进行，缩短耗时以减少误差。

1.3.4 膜电位检测 取新鲜心肌组织20 mg，冰上匀浆提取线粒体，按试剂盒配制JC−1缓冲液，将碳酰氰基−对−氯苯腙（CCCP）稀释成10 μmol/L，制备阳性对照，于不透光96 孔板中加入JC−1 检测工作液及样本，充分混匀后采用荧光显微镜检测JC−1单体及聚合体激发光与发射光荧光值。以膜电位聚合体与单体红/绿荧光比值（R/G）为最终结果。该指标同样需以新鲜组织、低温环境下提取线粒体，除需保证细胞存活及线粒体膜完整性外，JC−1 工作液染色后也需立即观察，以减少荧光淬灭。该指标与线粒体ATP 检测同时进行，每组取5只。

1.3.5 组织病理学分析 取左心室组织固定于4%多聚甲醛48 h，脱水包埋组织，切片（4 μm），并行苏木精−伊红（HE）染色及Masson 染色。样品于光学显微镜下观察、摄片。采用Image J软件进行心肌纤维化程度相对定量分析，心肌胶原容积百分比（collagen volume fraction，CVF%）=阳性蓝染面积/组织总面积×100%。因5−Fu 所诱导的心脏毒性以心肌收缩力下降为主［5−6］，左心室结构及功能为评估心脏受损的良好指标，同时为使组织充分固定，避免裂片及染色不均，故选取左心室进行病理（HE、Masson、LC3Ⅱ）及电镜观察。因模型组死亡3只，每组取4只进行观察分析。

1.3.6 电镜观察线粒体超微结构 取新鲜左心室心肌组织切成体积＜1 mm3的组织块，于2.5%戊二醛固定液中固定24 h，冲洗后，于1%锇酸固定液固定2 h，梯度乙醇脱水，环氧树脂包埋后超薄切片机切片，超薄切片经枸橼酸铅、醋酸铀双重染色后，嵌入环氧树脂。样品于透射电镜下观察、摄片。

1.3.7 LC3Ⅱ免疫荧光染色检测 心肌石蜡切片常规脱蜡、脱水，置于加入柠檬酸修复液（pH=6.0）的修复盒中，中火8 min 煮沸，保温数分钟后中小火7 min。自然冷却后洗涤。10%山羊血清室温封闭30 min。加入LC3Ⅱ一抗，4 ℃过夜。一抗修复完毕后复温、洗涤；滴加二抗，室温避光孵育60 min。洗涤后滴加DAPI，室温避光染核5 min，PBS 冲洗。封片后荧光显微镜下观察、摄片。采用Image J 软件进行阳性标记计数。

1.3.8 蛋白质免疫印迹分析 取新鲜心肌组织匀浆提取线粒体蛋白，BCA法定量、SDS−PAGE电泳分离、转膜，4 ℃过夜孵育PINK1、Parkin、Beclin1、LAMP、COX−Ⅳ抗体（稀释度均为1∶500）及LC3 抗体（稀释度为1∶1 000），次日洗膜后以辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG 抗体（稀释度为1∶1 000）继续孵育90 min。扫描胶片，采用Image J软件进行相对定量分析，各目的蛋白以COX−Ⅳ（内参蛋白）进行校正。

1.4 统计学方法 采用SPSS 23.0对数据进行统计分析。符合正态分布计量资料采用表示，各组间比较采用单因素方差分析，结合Tukey's检验进行多重比较，非正态分布数据采用非参数检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠一般情况 对照组大鼠饮食活动情况良好，体质量保持稳定状态。模型组出现活动力差，纳差，并伴有不同程度的腹泻症状，自给药第6天起体质量下降。经AS−Ⅳ干预后，大鼠精神状态及摄食情况优于模型组，体质量下降幅度较小。实验过程各组大鼠体质量变化趋势，见图1。

Fig.1 Changes of rat body weight in each group图1 各组大鼠体质量变化

2.2 3 组大鼠心肌酶变化 与对照组相比，模型组血清 cTnI 及 CK−MB 水平明显升高（P＜0.05），而AS−Ⅳ组上述心肌酶指标较模型组显著降低（P＜0.05），见表1。

Tab.1 Comparison of CK-MB and cTnI levels between three groups表1 各组大鼠血清CK-MB及cTnI水平比较（ng/L，）

Tab.1 Comparison of CK-MB and cTnI levels between three groups表1 各组大鼠血清CK-MB及cTnI水平比较（ng/L，）

＊P＜0.01；a与对照组比较，b与模型组比较，P＜0.05

组别对照组模型组AS−Ⅳ组F n6 6 6 cTnI 44.71±6.56 147.45±33.64a 109.84±29.03ab 20.535＊CK−MB 26.20±7.49 143.18±38.74a 77.78±27.24ab 13.456＊

2.3 3组大鼠心肌线粒体功能损伤情况 与对照组相比，模型组线粒体ATP 水平及膜电位均明显下降（P＜0.05）。与模型组相比，AS−Ⅳ组ATP 水平显著升高（P＜0.05），膜电位R/G 比值2 组间差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

Tab.2 Comparison of MMP and ATP levels between three groups表2 各组大鼠心肌组织线粒体膜电位及ATP水平比较（）

Tab.2 Comparison of MMP and ATP levels between three groups表2 各组大鼠心肌组织线粒体膜电位及ATP水平比较（）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a与对照组比较，b与模型组比较，P＜0.05

组别对照组模型组AS−Ⅳ组F n5 5 5 ATP（μmol/g）0.88±0.18 0.36±0.05a 0.64±0.15ab 13.062＊＊膜电位（R/G）1.97±0.44 0.95±0.34a 1.50±0.33 5.610＊

2.4 3组大鼠心肌纤维化变化 HE染色结果：对照组心肌纤维排列整齐，未见特异性病理改变；模型组心肌细胞排列欠规则，心肌纤维略显粗大，部分细胞核深染浓集；AS−Ⅳ组心肌纤维排列欠规则，但并无明显特异性病理改变。Masson 染色结果：对照组心肌间质纤维可见少量蓝染区域，呈轻微纤维化表现；模型组心肌纤维增粗，间隔增大，可见较多间质蓝染区，纤维化程度较重；AS−Ⅳ组心肌间质仍可见纤维化，但程度较模型组减低，见图2。与对照组胶原容积百分比（3.53%±0.88%）相比，模型组（16.74%±1.84%）升高，与模型组相比，AS−Ⅳ组（10.18%±0.87%）明显减低（F=40.331，P＜0.05）。

2.5 3组大鼠心肌线粒体结构及功能变化 对照组心肌细胞质膜完整，肌丝排列整齐，线粒体结构正常，线粒体嵴排列致密，可见单个自噬小体；模型组表现为线粒体稀疏，核周间隙扩张，线粒体部分肿胀、固缩，形态不均，并可见较多脂滴沉积及自噬小体，线粒体结构破坏较为严重；AS−Ⅳ组显示线粒体排列欠规则，线粒体出现肿胀，但形态及结构大致正常，其间可见单个散在自噬泡，见图3。

2.6 3组大鼠心肌组织LC3Ⅱ表达水平比较 与对照组 LC3 Ⅱ表达量（84.00±7.55）相比，模型组（167.75±14.01）升高，与模型组相比，AS−Ⅳ组LC3Ⅱ表达量（120.05±16.09）则减低（F=35.321，P＜0.05），见图4。

Fig.2 The pathological morphology of myocardial tissues under light microscope bebween the three groups图2 3组大鼠心肌组织光镜下病理形态变化

Fig.3 The pathological morphology of myocardial mitochondria under electron microscope bebween the three groups图3 3组大鼠电镜下心肌线粒体形态变化

Fig.4 The protein expression levels of LC3Ⅱ in myocardial tissues(×400)图4 3组大鼠心肌组织LC3Ⅱ免疫荧光标记染色（×400）

2.7 3组大鼠心肌线粒体自噬PINK1/Parkin 信号通路相关蛋白表达水平 与对照组相比，模型组Beclin1、PINK1、Parkin、LAMP 及LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白相对表达量升高（P＜0.05），AS−Ⅳ组 Beclin1、PINK1、Parkin、LC3Ⅱ/Ⅰ及LAMP 表达量则较模型组减低（P＜0.05），见图5、表3。

Fig.5 The proteins expressions of PINK1/Parkin pathway in myocardial tissues图5 大鼠心肌组织PINK1/Parkin通路相关蛋白表达情况

Tab.3 Comparison of the protein expression of PINK1/Parkin pathway in myocardial tissues between three groups表3 大鼠心肌组织PINK1/Parkin通路相关蛋白表达比较（n=4，）

Tab.3 Comparison of the protein expression of PINK1/Parkin pathway in myocardial tissues between three groups表3 大鼠心肌组织PINK1/Parkin通路相关蛋白表达比较（n=4，）

＊＊P＜0.05，＊P＜0.01；a与对照组比较，b与模型组比较，P＜0.05

组别对照组模型组AS−Ⅳ组F 0.73±0.12 1.54±0.13a 1.26±0.21ab 33.365＊＊1.01±0.66 1.54±0.20a 1.19±0.13b 7.774＊组别对照组模型组AS−Ⅳ组F Parkin 0.77±0.27 1.62±0.09a 1.06±0.11b 8.949＊LAMP 0.61±0.09 1.21±0.12a 0.91±0.13ab 22.935＊＊LC3Ⅱ/Ⅰ1.09±0.18 1.43±0.95a 1.16±0.10b 5.309＊Beclin1PINK1

3 讨论

5−Fu用于化疗时存在潜在且严重的心脏毒性，在关注高龄患者化疗药物心脏毒性损伤的同时，需更加关注其心脏毒性的预防及治疗。

5−Fu引起心脏毒性的发病机制是多方面的，线粒体损伤是一种机制假说。药理机制研究指出5−Fu 体内代谢产物氟−柠檬酸（F−Cltrate）可作用于线粒体，阻断三羧酸循环，减少ATP 产生，改变线粒体膜通透性，从而导致线粒体功能异常［7］。线粒体损伤导致有缺陷的细胞器逐渐积累，由此线粒体自噬被启动［8］。自噬是一种程序化的细胞内降解过程，平衡的自噬可满足代谢需要、细胞器更新及维持细胞稳态［9］。自噬的激活通常被认为具有心脏保护性，而过度的自噬导致细胞死亡和心肌受损［10−11］。

PINK1/Parkin 信号通路是已知的研究较为深入的线粒体自噬信号通路，其参与多种心血管系统疾病的发生发展［12−13］。Kubli 等［14］证实沉默 PINK1 基因后心肌细胞中线粒体功能受损，氧化应激水平增高，进而引起心力衰竭。Givvimani 等［15］在小鼠升主动脉缩窄诱导的心力衰竭模型中也发现抑制线粒体自噬后可明显减少升主动脉缩窄引起的心肌纤维化。因此，自噬的动态变化对心血管疾病具有不同的意义，即维持平衡状态的自噬有益于心肌保护，但线粒体自噬过度则可能加重心肌损伤。本研究大鼠在经5−Fu 刺激后线粒体自噬PINK1/Parkin 信号通路相关蛋白Beclin1、PINK1、Parkin、LAMP和LC3Ⅱ/Ⅰ比值升高，提示线粒体自噬参与了5−Fu诱导的心肌损伤，且线粒体可呈现自噬过度状态。

黄芪是经典的多效中药之一，临床用于冠心病、心绞痛的治疗且已取得显著疗效［16］。AS−Ⅳ是黄芪的主要成分之一，研究表明AS−Ⅳ通过激活一氧化氮合成酶（NOS）产生一氧化氮（NO），从而激活cGMP/PKG 信号通路，进一步使糖原合成酶激酶−3（GSK−3）失活，抑制线粒体通透性转换孔（mPTP）开放，发挥心肌线粒体保护作用［17］；同时AS−Ⅳ能够下调心肌组织磷酸化缝隙连接蛋白3（P−Cx3）以及Caspase−3表达水平，上调Bcl−2的表达，从而抑制心肌细胞凋亡［18］。

基于以上研究基础，笔者参照 Li 等［19−20］干预方式以观察AS−Ⅳ对化疗药物心脏损伤的保护作用。本研究发现，在5−Fu 诱导的心脏毒性模型中给予AS−Ⅳ干预能改善大鼠的一般状况，包括体质量、摄食及精神状态；此外，组织病理学检测以及心肌酶学检测结果均表明AS−Ⅳ可减轻心肌细胞损伤、减缓心肌组织纤维化进展，并能改善心肌细胞线粒体质量，从而缓解化疗药物对心肌的损伤。

线粒体质量控制是维持细胞正常活动的关键，线粒体自噬过程对于质量控制至关重要［21］。研究表明AS−Ⅳ通过PINK1/Parkin 信号通路参与多种心血管疾病的预防及治疗［22−23］。黄莉等［24］以心肌缺血再灌注模型观察AS−Ⅳ对细胞自噬及心肌组织损伤的影响，结果表明AS−Ⅳ能够降低Beclin1 的表达，抑制自噬从而保护心肌。为进一步探索AS−Ⅳ参与调节线粒体自噬的分子机制，本研究对PINK1/Parkin信号通路蛋白表达进行定量，结果表明AS−Ⅳ可降低Beclin1和LAMP蛋白表达。LAMP为溶酶体膜蛋白，可用于监测自噬体与溶酶体融合状态，AS−Ⅳ干预后LAMP 蛋白表达水平降低，提示线粒体自噬通量下降，表明AS−Ⅳ可通过抑制线粒体自噬PINK1/Parkin通路过度激活，调控自噬稳定状态，从而维持心肌线粒体数量与质量的内稳态。

综上，AS−Ⅳ可减轻5−Fu诱导心肌损伤，其机制可能是AS−Ⅳ通过调节线粒体自噬稳态，改善线粒体质量，从而发挥心肌细胞保护作用。本研究在动物实验基础上初步探索了AS−Ⅳ在预防及改善5−Fu诱导心肌毒性中的作用与机制，为肿瘤患者尤其是老龄患者临床化疗安全性提供了新的干预策略及研究方向。