鸡源大肠杆菌M1株的分离鉴定及遗传进化分析

王育伟，刘亚东，周玉刚，张晓晖，周爱民，李廷见

（绵阳市农业科学研究院畜禽水产研究所，四川 绵阳 621023）

大肠杆菌（E.coli）是养殖环境中存在最为广泛的病原菌之一［1］，常单独或混合感染引起家禽细菌性疾病，每年给家禽养殖业造成了巨大的经济损失。E.coli单纯感染可引起禽大肠杆菌病［2］，主要症状包括心包炎、失明、腹泻、滑膜炎、大肠杆菌性肉芽肿和脐炎等。常与沙门氏菌（Salmonella）和鸡毒支原体（Mycoplasma gallisepticum，MG）共同感染引起鸡白痢、鸡毒支原体病等疾病［3］。

细菌鉴定对精准的用药和疾病防控具有重要意义，除了常规的形态学鉴定方法以外，分子生物学鉴定方法因分型精确等优点而成为重要的鉴定方法。16S rDNA 序列是研究细菌系统发育和分类最常用的管家遗传标［4］，atpD 基因等功能基因也非常有助于细菌进化分析［5］。本研究对从绵阳一养鸡场腹泻病例中分离到的M1菌进行鉴定，并建立16S rDNA 和atpD 基因遗传进化分析，为科学防控该类疾病提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料 从四川省绵阳市游仙区一养鸡场腹泻病例中分离出1 株细菌，命名为M1 菌。

1.2 主要试剂 糖铁琼脂、麦康凯培养基，购自成都康迪生物科技有限公司；伊红美蓝培养基，购自青岛日水生物技术有限公司；微量生化反应管，购自杭州天和微生物试剂有限公司；细菌基因组DNA 提取试剂盒（TIAN amp Bacteria DNA Kit），购自天根生化科技（北京）有限公司。

1.3 菌株的分离培养 将采样拭子置于5 mL LB 培养基中，37 ℃振荡培养6～8 h，然后于普通固体培养基上划线，37 ℃培养24 h，革兰氏染色后镜检，观察细菌形态。用接种针挑取形态、大小不同的单菌落在固体培养基上培养24 h（37 ℃），挑取深紫色带有金属光泽的单菌落于麦康凯固体培养基上划线培养，观察菌落形态，然后进行革兰氏染色、镜检。

1.4 生化试验鉴定 将初步分离到的菌株纯化扩菌后，取菌液分别接种于硫化氢、苯丙氨酸、葡萄糖酸盐、蛋白胨水、葡磷胨水、枸橼酸盐、尿素、赖氨酸、鸟氨酸、棉子糖、山梨醇、侧金盏花醇、木胶糖、七叶苷培养基中，37 ℃温箱培养6～48 h，观察并记录试验结果。

1.5 细菌基因组DNA提取 取单菌落接种于5mL培养基中37 ℃培养24 h，取1.0 mL 菌液于1.5 mL离心管中，13 000 r/min 离心2 min，弃上清。沉淀重悬于1.0mL 0.85% NaCl中。室温下13000r/min离心2 min，弃上清。沉淀重悬于550 μL 1×TE缓冲液中。加17 μL 溶菌酶（35 mg/mL），37 ℃温育30 min。加3 μL 蛋白酶K（20 mg/mL），37 ℃温育30 min。加30 μL 10% SDS，37 ℃温育30 min。加100 μL 5 M NaCl 充分混匀。加80 μL CTAB/NaCl 溶液，混匀，65 ℃水浴10 min。加等体积（0.7～0.8 mL）氯仿/异戊醇（24∶1），轻轻振荡混匀。室温下13000r/min离心10 min。将上清液转移到一新的1.5 mL 离心管中，加入等体积酚/氯仿/异戊醇（25∶24∶1），轻轻振荡混匀。再将上清液转移到一新的1.5 mL离心管中，加入等体积氯仿/异戊醇（24∶1），轻轻振荡混匀。弃上清，加500 μL 70%乙醇，轻轻颠倒数次（洗盐）。4 ℃15 000 r/min离心7 min。重复洗盐两次。倒置离心管，干燥DNA沉淀7 min。DNA 沉淀溶于100 μL 1×TE缓冲液，-20 ℃保存备用。

1.6 16S rDNA系统进化分析 设计16S rDNA引物送生工生物工程（上海）股份有限公司合成，提取M1 菌株的16S rDNA，PCR 产物经回收纯化后测序，利用NCBI 中BLAST 程序将分离菌株的16S rDNA 序列与GenBank 数据库中已知基因序列进行比对。利用生物信息学软件DNAStar 和MEGA6 对分离菌株与部分大肠杆菌的核苷酸序列进行同源性比对分析，并构建系统进化树。16S rDNA 的PCR 扩增反应体系为100 mL：Taq（5 U/mL）0.8 mL，10×PCR Buffer（Mg2＋Plus）10 mL，dNTP Mixture（2.5 mmol/each）8 mL，模 板DNA 2.5 ng，引物F1 和R1（10 mol/L）各2 mL，ddH2O 补足到100mL。反应条件为：95℃5min；95℃1min，57 ℃1 min，72 ℃60 s，30 个循环；72 ℃5 min。16S rDNA引物序列如表1所示。

表1 16S rDNA与atpD基因引物序列

1.7atpD 基因系统进化分析 设计atpD 基因引物送生工生物工程（上海）股份有限公司合成，提取M1 菌株的atpD 基因，PCR 产物经回收纯化后测序，利用BLAST 软件对相似菌株的atpD 基因序列进行比对，利用MEGA6 软件中的最大可能性法构建系统进化树。100 mLatpD 基因反应体系为：Taq（5 U/mL）0.8 mL，10×PCR Buffer（Mg2＋Plus）10 mL，dNTP Mixture（2.5 mmol/each）8 mL，模板DNA 2.5 ng，引物F1 和R1（10 mol/L）各2 mL，ddH2O 补足到100 mL。反应条件为：95 ℃5 min；95 ℃1 min，3 个循环；55 ℃135 s，72 ℃ 75 s，95 ℃ 35 s，30 个 循 环；55 ℃ 75 s，72 ℃5 min，72 ℃7 min。atpD 基因引物序列如表1所示。

2 结果与分析

2.1 细菌培养与分离鉴定 M1 菌接种在LB 肉汤纯化至镜检为单一细菌形态，在普通固体培养基上生长出圆形、光滑、边缘整齐或不太整齐的乳白色中等偏大菌落，在麦康凯培养基上呈桃红色。革兰氏染色后在油镜下可以观察到两端钝圆的粉红色短杆菌，革兰氏阴性，散在或成对出现。

2.2 生理生化试验 生理生化试验结果表明，M1菌可以发酵多种糖类，产酸产气；运动性试验为阳性；吲哚（I）试验、甲基红（M）试验为阳性；VP（V）试验和枸橼酸盐（C）利用试验为阴性；产硫化氢（H2S）试验为阴性；尿素酶试验为阴性；触酶试验为阳性。根据《常见细菌系统鉴定手册》判定，M1菌符合大肠杆菌的生化特征。

表2 M1菌与其他菌株的序列同源性表（同源性＝1-差异率×100%）

2.3 16S rDNA 系统进化与同源性分析 将16S rDNA序列与GenBank中的相近序列进行比对，从16S rDNA 序列的同源性分析结果来看，M1 菌株与E.coli、痢疾志贺菌、马尔莫拉大肠杆菌等菌的同源性均在99%以上。利用MEGA6.0构建了M1与参考菌株的16S rDNA 序列系统进化树（见图1），结果表明，M1与鲍氏志贺菌（Shigella boydii）和宋氏志贺菌（Shigella sonnei）的同源性相近，判定M1属于肠杆菌科细菌。

图1 M1菌株与相关种的16S rDNA序列系统进化树分析

2.4atpD 基因序列同源性与系统进化分析 将atpD 基因序列与GenBank 中相近序列进行比对，结果表明，M1 菌株与E.coli、鲍氏志贺菌（Shigella boydii）和宋氏志贺菌（Shigella sonnei）序列的同源性在99.9%以上（见表2）。利用MEGA6.0分子生物学软件构建M1 菌株和相关种的atpD 基因系统进化树（图2），表明M1分离株与志贺氏菌和E.coli的亲缘关系较近。从功能基因同源性分析结果来看，M1 菌株与E.coli的同源性最高，鉴定M1菌属于肠杆菌科大肠杆菌属。

图2 M1菌株与相关种的atpD基因序列系统进化树分析

3 结论与分析

为明确从腹泻肉鸡病例中分离到的M1 菌株的生物学特性，本试验进行了纯化培养和生物学鉴定。结果显示M1 菌落外观呈白色凸起，镜下外观为两端椭圆杆状G-菌；结合生化试验结果，发现M1 菌株符合大肠杆菌的生化特性，与由佳等［6］研究的结果一致。分子检测方法在细菌鉴定中具有高度特异性和敏感性特征，本研究借助16S rDNA 和功能基因atpD 基因序列进行类群及系统发育分类，并与GenBank 中相近序列进行比对，结果显示M1 菌株与E.coli、志贺菌等种的序列同源性在99%以上，进化树分析得出M1 与鲍氏志贺菌和宋氏志贺菌的家族关系较近。综合传统细菌鉴定、生理生化试验与16S rDNA、atpD 基因进化分析结果，证实所分离M1菌属于大肠杆菌。