甲醛灭活猪圆环病毒2 型基因工程亚单位疫苗抗原液的最佳条件研究

胡江锋，张志刚，陈瑞，张小娟

（1.杨凌绿方生物工程有限公司，陕西 杨凌 712100；2.陕西省兽用生物制品工程技术研究中心，陕西 杨凌 712100；3.陕西诺威利华生物科技有限公司，陕西 杨凌 712100）

猪圆环病毒（PCV）病是由猪圆环病毒引起的猪的一种多系统功能障碍性疾病［1］。现已知PCV有两个血清型，即PCV1 和PCV2，PCV1 为非致病性病毒，PCV2为致病性病毒，能引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）［2］。该病毒1974年由德国学者Tischer首先从传代的PK-15细胞中发现，我国最早则由朗洪武等［3］于2001 年报道。接种疫苗是预防由PCV2感染引发相关疾病的首要手段。在国内市场上，生产和销售的猪圆环病毒2型疫苗类型主要有全病毒灭活疫苗和基因工程亚单位疫苗［4］。在疫苗制备过程中，抗原灭活是最关键的技术环节之一，抗原灭活效果直接影响到产品的质量，甚至波及人类生命安全。目前，甲醛是最传统、应用最广泛的化学灭活剂［5］，但甲醛浓度不够，灭活就不彻底，容易引起疫苗安全事故，造成病毒扩散；甲醛浓度偏大，虽灭活彻底，但有甲醛残留，游离的甲醛随疫苗注入动物机体后会产生刺激性反应，甚至人类食用了注射部位有甲醛残留的畜产品，会有致癌风险［6］。本试验探究了不同终浓度的甲醛对猪圆环病毒2型基因工程亚单位疫苗抗原液灭活的效果，为该苗商品化、规模化生产时设置最佳灭活条件提供数据参考。

1 材料与方法

1.1 材料 无菌猪圆环病毒2 型基因工程亚单位疫苗抗原液（蛋白浓度为660 μg/mL），由陕西诺威利华科技有限公司提供；96孔PK-15细胞单层培养板、FITC 标记的羊抗猪二抗、MEM 维持液、D-氨基葡萄糖盐酸MEM，由杨凌绿方生物工程有限公司提供；无菌检验培养基、PBS（0.01 mol/L，pH 7.4）、10%甲醛溶液，由杨凌绿方生物工程有限公司提供；丙酮（分析纯），购自成都市科隆化学品有限公司，批号：2018030601。

1.2 方法

1.2.1 取猪圆环病毒2型基因工程亚单位疫苗抗原液，摇匀，均分为5 瓶，每瓶400 mL，分别加入10%甲醛溶液，边加边摇，使甲醛终浓度分别为0.05%、0.07%、0.10%、0.15%和0.20%，置4～8 ℃下灭活72 h，期间每2 h 摇瓶一次。分别在灭活24 h、48 h、60 h 和72 h 时无菌取样，按无菌检验法［7］和灭活检验方法［8］进行抗原液灭活效果的检验。

1.2.2 抗原液量增至每瓶3 000 mL，按1.2.1 方法和要求进行灭活、取样和检验。

1.2.3 抗原液量增至每瓶10 000 mL，按1.2.1 方法和要求进行灭活、取样和检验。

2 结果

2.1 小量（400 mL）抗原液的灭活效果 不论甲醛终浓度为多少，每个测定时间点的灭活液均无细菌污染。当甲醛终浓度为0.05%时灭活24 h、48 h、60 h、72 h，甲醛终浓度为0.07%时灭活24 h、48 h、60 h，甲醛终浓度为0.10%时灭活24 h、48 h，甲醛终浓度为0.15%时灭活24 h，灭活检验的细胞均产生了特异性病变（CPE），说明这些灭活条件不能彻底灭活猪圆环病毒2型基因工程亚单位疫苗抗原液。当甲醛终浓度为0.07%时灭活72 h，甲醛终浓度为0.10%时灭活60 h，甲醛终浓度为0.15%时灭活48 h，甲醛终浓度为0.20%时灭活24 h，灭活检验的细胞均未产生CPE，说明这些灭活条件能彻底灭活猪圆环病毒2型基因工程亚单位疫苗抗原液。结果详见表1。

2.2 中等量（3 000 mL）抗原液的灭活效果 不论甲醛终浓度为多少，每个测定时间点的灭活液均无细菌污染。当甲醛终浓度为0.05%时灭活24 h、48 h、60 h、72 h，甲醛终浓度为0.07%时灭活24 h、48 h、60 h，甲醛终浓度为0.10%、0.15%时灭活24 h、48 h，灭活检验的细胞均产生了特异性病变（CPE），说明这些灭活条件不能彻底灭活猪圆环病毒2 型基因工程亚单位疫苗抗原液。当甲醛终浓度为0.07%时灭活72 h，甲醛终浓度为0.10%、0.15%时灭活60 h，甲醛终浓度为0.20%时灭活24 h，灭活检验的细胞均未产生CPE，说明这些灭活条件能彻底灭活猪圆环病毒2 型基因工程亚单位疫苗抗原液。结果详见表2。

表1 不同浓度甲醛对400 mL抗原液的灭活效果

2.3 大量（10 000 mL）抗原液的灭活效果 不论甲醛终浓度为多少，每个测定时间点的灭活液均无细菌污染。当甲醛终浓度为0.05%时灭活24 h、48 h、60 h、72 h，甲醛终浓度为0.07%时灭活24 h、48 h、60 h，甲醛终浓度为0.10%、0.15%时灭活24 h、48 h，甲醛终浓度为0.20%时灭活24 h，灭活检验的细胞均产生了特异性病变（CPE），说明这些灭活条件不能彻底灭活猪圆环病毒2型基因工程亚单位疫苗抗原液。当甲醛终浓度为0.07%时灭活72 h，甲醛终浓度为0.10%、0.15%时灭活60 h，甲醛终浓度为0.20%时灭活48 h，灭活检验的细胞均未产生CPE，说明这些灭活条件能彻底灭活猪圆环病毒2型基因工程亚单位疫苗抗原液。结果详见表3。

表2 不同浓度甲醛对3 000 mL抗原液的灭活效果

表3 不同浓度甲醛对10 000 mL抗原液的灭活效果

3 结论与分析

本试验在已设定灭活温度条件下，采用不同终浓度的甲醛灭活剂多次灭活不同量的猪圆环病毒2 型基因工程亚单位疫苗抗原液，通过对抗原灭活液的无菌检验及灭活检验，确定了能彻底灭活猪圆环病毒2型基因工程亚单位疫苗抗原液的时间。结果得出，在4～8 ℃下采用0.07%甲醛终浓度灭活72 h，或0.10%和0.15%甲醛终浓度灭活60 h，或0.20%甲醛终浓度灭活48 h，均可达到彻底灭活猪圆环病毒2型基因工程亚单位疫苗抗原液的目的。由于甲醛具有毒副作用及致癌性，为尽量减少其使用量，因而笔者倾向于采用0.07%甲醛终浓度于4～8 ℃灭活72 h，作为猪圆环病毒2型基因工程亚单位疫苗抗原液较理想的灭活条件。

为进一步准确分析、改善、调整、验证猪圆环病毒2型基因工程亚单位疫苗抗原液的最佳灭活条件，本试验设定的时间区段有待再度细分并进行相应的试验探究。