吉林部分地区TTSuVs与PCV2混合感染情况调查及其与PMWS相关性分析

刘东旭，沙万里,尹柏双,李国江*

(1.吉林农业科技学院，吉林 吉林 132101；2.吉林省教育厅预防兽医学吉林省重点实验室，吉林 吉林 132101)

仔猪断奶后多系统衰竭综合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)是一种重要的病毒性传染病，它能造成仔猪全身各系统不同程度的功能丧失。该病主要由猪圆环病毒2型(porcine circovirus tape 2，PCV2)引起[1]。猪细环病毒(Torque teno sus viruses，TTSuVs)最早发现于2002年，现流行于多个国家的猪群中，目前被分成2个基因型，即TTSuV1和TTSuV2[2]。临床研究表明，猪群单一感染TTSuVs并不能引起明显的临床症状；猪群单一感染PCV2也同样不会引起明显的临床症状，但猪群混合感染两种病原体时，会促进PMWS的发生。这使得关于TTSuVs在猪群中的感染情况及潜在的致病性成为研究的热点[3]。

为此，本研究对吉林部分地区TTSuVs与PCV2混合感染情况进行调查，并分析PMWS病猪及PCV2亚临床感染猪体内TTSuVs的载量，这将有助于进一步认识TTSuVs在猪群中的感染情况及其潜在致病性，为研究TTSuVs的致病机理及PCV2等疾病的防制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

病毒基因组提取试剂盒、Premix Ex TaqTM(Probe qPCR)、RNaseA，购自TaKaRa公司。

1.2 血清样品

2019年1月起从吉林省10家规模化猪场随机收集到的血清样品130份。

1.3 引物及探针

检测应用实验室已有的PCV2和TTSuVs荧光定量PCR引物和探针，引物和探针具体信息见表1所示。

表1 PCR扩增引物序列信息Table 1 PCR primer sequence information

1.4 TTSuVs和PCV2流行情况调查

将2019年1月起从吉林省10家规模化猪场收集到的130份血清样品，按照TaKaRa公司病毒基因组提取试剂盒说明书提取病毒DNA。应用刘建波等[4]建立设计的TTSuVs及PCV2引物对提取的病毒基因组进行PCR检测，并统计分析吉林地区2019年TTSuVs和PCV2的感染情况。

1.5 PMWS病猪样品及PCV2亚临床感染样品的确定

应用本实验室已建立好的PCV2 TaqMan荧光定量PCR检测方法对血清样品中PCV2的浓度进行检测(扩增程序：预变性，95 ℃ 30 s；变性，95 ℃ 10 s；退火，56.6 ℃ 30 s；35个循环)，根据血清样品中的PCV2浓度，应用公式：Copies/mL=6.02×1023×浓度/平均分子量，计算病毒拷贝数，并根据计算结果区分PMWS病猪样品及PCV2亚临床感染样品。

1.6 TTSuVs载量与PMWS相关性分析

应用本实验室已建立好的TTSuVs TaqMan荧光定量PCR检测方法对1.5中的PMWS病猪样品及PCV2亚临床感染样品进行TTSuVs载量分析(TTSuV1扩增程序：预变性，95 ℃ 30 s；变性，95 ℃ 10 s；退火，54.6 ℃ 30 s；35个循环。TTSuV2扩增程序：预变性，95 ℃ 30 s；变性，95 ℃ 10 s；退火，55.6 ℃ 30 s；35个循环)。用t检验方法对PMWS病猪和PCV2亚临床感染猪PCV2载量、TTSuVs载量分别进行差异显著性分析，并对三种病毒载量进行直线相关分析。

2 结果与分析

2.1 吉林部分地区TTSuVs和PCV2流行情况调查

对2019年1月起从10家规模化猪场收集到的130份血清样品进行PCR鉴定，结果见表2。其中共检出50份TTSuV1阳性样品，其感染率为38.46%；75份TTSuV2阳性样品，感染率为57.69%；60份PCV2阳性样品，感染率为46.15%；TTSuV1与TTSuV2的混合感染样品有41份，混合感染率为31.54%；TTSuV1与PCV2的混合感染样品有42份，混合感染率为32.30%；TTSuV2与PCV2的混合感染样品有58份，混合感染率为44.62%；三种病毒的混合感染样品有29份，混合感染率为22.30%。且中部地区为吉林主要发病地区，结果见表3。

表2 2019年吉林地区TTSuVs和PCV2流行情况调查Table 2 Epidemic survey of TTSuVs and PCV2 in Jilin in 2019

表3 吉林地区2018年TTSuVs及PCV2分布情况Table 3 Distribution of TTSuVs and PCV2 in Jilin Region in 2018

2.2 PMWS病猪样品及PCV2亚临床感染样品的确定

对PCV2阳性病料，应用本实验室已建立的荧光定量PCR检测方法对其中PCV2的载量进行测定。资料显示，PCV2感染猪发展成为PMWS病猪所需要的病毒载量的临界值是，每微升血清中含有的病毒载量为1×104copies[5]。故参考这个标准，将血清中PCV2载量低于1×104copies/μL的判定为PCV2亚临床感染，将血清中PCV2载量高于1×104copies/μL的判定为PMWS病猪。根据此标准检测的130份样品中个，PCV2亚临床感染45份，PMWS病猪47份。其中PMWS病猪血清中PCV2载量范围介于104.13～106.91copies/μL之间，平均值为105.32copies/μL；PCV2亚临床感染猪中PCV2载量范围介于100.91～103.68copies/μL之间，平均值为101.72copies/μL。PMWS病猪血清中PCV2载量高于PCV2亚临床感染猪，并且二者之间差异性显著(P<0.05)，结果见表4。

表4 PMWS病猪、PCV2亚临床感染猪血液样本中三种病毒载量比较Table 4 Comparison of three viral loads in blood samples from PMWS diseased pigs and PCV2 subclinically infected pigs(Log10(DNA)(copies/μL))

2.3 PCV2亚临床感染猪与PMW病猪的TTSuVs载量比较分析

对检测的45份PCV2亚临床感染样本和47份PMWS病猪样本，用本研究建立的荧光定量PCR方法检测其中的TTSuVs载量。结果如表5所示。结果表明，PMWS病猪血清中TTSuV1载量范围介于0～103.21copies/μL之间，平均值为101.36copies/μL；PCV2亚临床感染猪中TTSuV1载量范围介于0～103.12copies/μL之间，平均值为101.58copies/μL。PMWS病猪血清中TTSuV1载量与PCV2亚临床感染猪TTSuV1载量差异性不显著(P>0.05)。PMWS病猪血清中TTSuV2载量范围介于0～103.52copies/μL之间，平均值为102.24copies/μL；PCV2亚临床感染猪中TTSuV2载量范围介于0～102.42copies/μL之间，平均值为101.34copies/μL。PMWS病猪血清中TTSuV2载量高于PCV2亚临床感染猪，并且二者之间差异性显著(P<0.05)。

2.4 TTSuV2载量与PCV2载量的相关性分析

通过上述数据分析可见，PMWS病猪血清中TTSuV2载量是高于PCV2亚临床感染猪的，并且二者之间差异性达到了显著水平，因此有必要进一步分析其间是否存在一定程度的相关性。将PCV2感染猪中PCV2载量的对数值与TTSuV2载量的对数值进行直线相关与回归分析，结果如图1所示。由图1可以看出，二者之间存在部分拟合性(R2=0.3441)，提示临床上TTSuV2感染与PMWS发生之间存在一定关联。

图1 血清中TTSuV2载量和PCV2载量之间的相关性分析Fig.1 Correlation analysis on TTSuV2 load and PCV2 load in serum

3 讨 论

PMWS的出现以及爆发对我国养猪行业造成了极大的经济损失。PMWS可见于5～16周龄猪，但最常见于6～8周龄。猪群患病率为3%～50%，死亡率在8%～35%。发病猪中大约有半数于2～8d内死亡，其他半数猪在衰弱状态下可存活数周，几乎没有康复的猪，致死率为80%～100%。本病发展缓慢，猪群一次发病可持续12～18个月。成年猪一般为隐性感染，常不表现任何症状和病变，但可以排毒。自PMWS报道以来，围绕着PMWS病原研究一直在进行。Ellis等[6]研究表 明PCV2与PMWS高度相关。然而PCV2是PMWS的主要病因，但可能不是唯一的病原。有研究表明TTSuVs与PCV2的混合感染会导致猪群发生PWMS。Ellis等[6]的研究发现，50%的猪在感染TTSuVl后，再感染PVC2会出现急性PMWS症状，而单独感染2种病毒的任何一种，或者先感染PCV2再感染TTSuVl均未出现PMWS症状，预示TTSuVl与PCV2混合感染时，可能导致猪群暴发PMWS。Kekarainen等[7]对西班牙PMWS和非PMWS猪群中TTSuVs感染情况的调查也发现，TTSuV2在PMWS发病猪群中的阳性率比非PMWS猪群明显偏高。

为此本项目对2019年吉林部分地区规模化猪场TTSuVs与PCV2混和感染情况进行调查。结果显示，TTSuV1其感染率为38.46%；TTSuV2感染率为57.69%； PCV2感染率为46.15%；TTSuV1与TTSuV2的混合感染率为31.54%；TTSuV1与PCV2的混合感染样率为32.30%；TTSuV2与PCV2的混合感染率为44.62%；三种病毒的混合感染率为22.30%。与李海超[8](PCV2感染率71.37%，；TTSuV1与PCV2的混合感染样率为44.05%；TTSuV2与PCV2的混合感染率为36.12%)和张青占[9]的调查结果部分相近(PCV2感染率75.73%；TTSuV1与PCV2的混合感染样率为32.02%；TTSuV2与PCV2的混合感染率为61.08%)，说明TTSuVs及PCV2混合感染已在我国多省份流行，但流行情况各个地域间差异较大。

应用建立的荧光定量PCR方法来检测TTSuV1、TTSuV2、PCV2的病毒载量，比较PMWS病猪与PCV2亚临床感染猪的血清中TTSuV1载量、TTSuV2载量、PCV2载量的差异。结果发现，PMWS病猪的血清中TTSuV2载量极显著的高于PCV2亚临床感染猪，两者之间存在差异性(P<0.01)，但前者的TTSuV1载量与后者并无显著差异。对所有PCV2感染猪的TTSuV2与PCV2载量的相关分析结果显示，二者之间有显著相关，提示TTSuV2感染与PMWS发生之间可能存在相关性，这与一些国内外研究资料基本一致[10-11]。这些资料除报道PMWS病猪的血液中的TTSuV2载量显著高于PCV2亚临床感染猪外，还报道前者的TTSuV2阳性率明显高于后者；本研究观察到类似现象。这说明随着PMWS的发生，TTSuV2载量同时增加，提示TTSuV2与PCV2之间在一定条件下，二者的混合感染完全可能引起一定比例的PMWS。