膨压处理对冬枣薄壁组织细胞微观力学特性的影响

朱韵昇，张海红，邱 雪，吴宝婷

（宁夏大学农学院 银川750021）

冬枣主要以鲜食为主，而质地是影响其鲜食品质的主要因素，果肉组织细胞壁内外渗透压差产生的膨压决定着其质地品质[1]。膨压是植物细胞内应力的主要来源。细胞内的膨压是均匀的、各向同性的，对细胞壁的应力不均一，与细胞壁厚度、形状、性质有关[2]。膨压作用于鲜枣的细胞壁上，使枣具有饱满、坚硬和新鲜的外观。冬枣的果皮较薄，木质素含量少，果肉主要是薄壁组织，含水量高，且枣的比表面积大，在贮藏过程中因呼吸和蒸腾作用，薄壁细胞极易失水皱缩，引起细胞内的膨压减小、水分流失、质地品质下降。研究不同膨压下冬枣组织细胞微观力学特性的变化，对冬枣的贮藏保鲜具有重要意义。

果蔬组织细胞的力学性质主要由细胞壁决定，如弹性、刚度、黏附力等都取决于细胞壁的结构、形状以及组成成分[3]。吴杰[4]、Oey[5]、Belie[6]等通过振荡剪切、单轴压缩、拉伸、穿刺等试验方法，研究膨压变化对果蔬组织的宏观黏弹性力学性质的影响。近年来，随着原子力显微技术的进步，原子力显微镜已成为研究生物细胞微观力学特性的有效工具，被广泛应用于生命和食品科学领域。原子力显微镜通过探针与样品表面接触产生的相互作用力得到力-距离曲线，通过分析曲线，来获取样品的弹性模量、刚度、黏附力等微观力学参数的局部变化。Pérez 等[7]使用原子力显微镜研究杨氏模量在苹果组织和分离细胞中的分布，结果表明苹果分离细胞的E 值分布较窄，杨氏模量平均值为（0.63±0.42）MPa，而苹果组织的杨氏模量为（0.86±0.81）MPa。Zdunek 等[8]用原子力显微镜研究梨采收前、后初生细胞壁杨氏模量的变化，结果发现采收前随着梨的成熟，细胞壁杨氏模量E 值呈线性下降，采收后呈上升趋势。目前，大多数研究集中于常膨压状态下果蔬细胞壁力学特性的研究，而针对不同膨压状态下的果蔬微观力学特性研究鲜有报道。本文利用不同浓度的甘露醇溶液对冬枣薄壁组织进行渗透处理，使冬枣薄壁细胞处于不同的膨压状态，并利用原子力显微镜对不同膨压下冬枣薄壁细胞进行纳米压痕试验，从微观力学层面揭示冬枣薄壁组织细胞膨压变化对细胞壁力学特性的影响，以期为冬枣贮藏期间温、湿度的调控提供一定的理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

冬枣采摘于宁夏灵武大泉林场红枣基地，选择新鲜饱满、果皮外表无损伤、大小均匀的枣果，置于4 ℃，相对湿度85%～95%的冰箱中贮藏。

甘露醇（C6H14O6），磷酸氢二钾（K2HPO4），磷酸二氢钾（KH2PO4），明胶，试验所用其它试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

原子力显微镜AFM （型号：PicoPlus），美国Agilent 公司；Si3N4探针（型号：PSA400，弹性系数0.18 N/m），日本Olympus 公司；光学显微镜（型号：LlGB-27）。

1.3 冬枣薄壁组织膨压处理方法

参考时兰春[2]质壁分离法，对冬枣薄壁组织细胞渗透处理，通过调节细胞内外渗透压的方式来改变细胞膨压；甘露醇作为一种非离子性渗透剂，很难进入细胞中，但可以引起细胞渗透压的改变，因此本试验以甘露醇作为冬枣薄壁细胞的渗透剂[9]。

配制0.20，0.25，0.30，0.35，0.40，0.45，0.50，0.55，0.60，0.65 mol/L 的甘露醇溶液各5 mL。取冬枣的果肉薄壁组织细胞为试验对象，试样的切片尺寸为10 mm×10 mm，厚度不超过5 mm，迅速投入含有不同浓度甘露醇溶液的试管中，使其完全浸没，约15 min。自高浓度开始依次取出冬枣组织切片于滴有相同浓度溶液的载玻片上，轻盖盖玻片，于光学显微镜下观察细胞质壁分离现象，每1制片观察的细胞不应少于100 个，记录质壁分离的相对程度。通过观察，确定使半数细胞原生质刚从细胞壁角隅处分离时的最低浓度和不引起细胞质壁分离的最高浓度，细胞等渗溶液的浓度等于这两种浓度的平均值。

试验表明，0.55 mol/L 甘露醇溶液是引起半数细胞质壁分离的最低浓度下限；而0.35 mol/L 的甘露醇溶液是细胞不发生质壁分离的最高浓度上限。由此确定0.45 mol/L 的甘露醇溶液为冬枣细胞的等渗点，以等渗点甘露醇溶液的浓度为标准，配置高渗点为0.8 mol/L 的甘露醇溶液和低渗点0.1 mol/L 的甘露醇溶液，处理冬枣薄壁组织，获得不同膨压状态的冬枣薄壁细胞。

依据公式：

式中：P——膨压，MPa；ψw——总水势，MPa；ψs——渗透势，MPa。

理论上估算出在0.1 mol/L 的低浓度甘露醇溶液中，细胞的膨压上升0.35 mol/L，0.45 mol/L 的甘露醇溶液中细胞的膨压下降为零，0.8 mol/L 的甘露醇溶液中，细胞的膨压下降为-0.35 mol/L[2]。

1.4 原子力显微镜压痕试验

试验前，将冬枣薄壁组织切成矩形薄片（10 mm×10 mm，厚度不超过5 mm），表面平整。用刚加热好的明胶溶液固定于35 mL 培养皿中，倒入对应浓度的甘露醇溶液，甘露醇溶液体积约为培养皿容量的2/3，同时滴加2～3 滴0.02 mol/L K2HPO4和0.02 mol/L KH2PO4配置的缓冲液（pH值5.2），使冬枣组织充分浸泡30 min，改变细胞的膨压状态[10]。

使用原子力显微镜自带的热调谐适配器（Themo K）获取探针的弹性系数，将处理好的冬枣组织样品置于载物台上。将探针移动到冬枣细胞上方，通过接触模式，在液体环境中对冬枣细胞进行压痕获取力-距离曲线（如图1）。不同处理组每次试验前多次测量敏感度进行校正。根据冬枣的自身特性，随机选择冬枣薄壁组织上细胞的位置，这些位置的选择靠近细胞核，施加一个垂直于细胞表面的力，避免压痕不垂直时产生的潜在偏差。每片组织随机选取20 个细胞点，每个细胞重复压痕10 次，共获取200 条力-距离曲线，探针加载速度为4 μm/s[11]。

根据赫兹模型分析探针逼近曲线，得到杨氏模量。

图1 AFM 力-距离曲线Fig.1 AFM force-distance curve

锥形探针，赫兹模型满足以下方程：

式中：F——探针对细胞施加的压力；E——杨氏模量；v——泊松比；α——探针半开角；δ——压痕深度。在此试验中，选择泊松比为0.5，α 半开角为35°。

2 数据处理与统计分析

使用原子力显微镜自带的AtomicJ 软件，对试验数据进行统计分析。分析不同膨压下，冬枣薄壁组织细胞杨氏模量和黏附力的分布差异以及表观刚度的变化；采用SPSS 22.0 软件对不同膨压处理组杨氏模量和黏附力进行方差分析，表达式形式为平均值±标准差（±s）。

3 结果与分析

3.1 不同膨压下长枣组织细胞杨氏模量的分布

杨氏模量可以表征冬枣的弹性状态，利用原子力显微镜得到的力-距离曲线，采用AtomicJ 统计软件，经数据处理，自动计算生成不同膨压下的杨氏模量E，并绘制分布直方图。

从图2a～c 中可知，高膨压（0.1 mol/L）时，冬枣细胞的杨氏模量E 值分布范围在2～30 kPa，平均杨氏模量E=（6.76±7.57）kPa；常膨压（0.45 mol/L）时，冬枣细胞的杨氏模量E 值分布范围较广在5～90 kPa，平均杨氏模量E=（20.21±16.95）kPa；低膨压（0.8 mol/L）时，冬枣细胞的杨氏模量分布较窄在1～20 kPa，平均杨氏模量E=（5.58±4.24）kPa，且3 种膨压下的杨氏模量均呈偏正态分布。

从图3可知，常膨压（0.45 mol/L）下杨氏模量E 值分布范围大于低、高膨压处理组，且存在异常值较多；而低、高膨压处理组的杨氏模量E 值分布范围相差较小，异常值较少。膨压从高到低，杨氏模量的分布范围表现出先增大后减小，剔除异常值后，高、低膨压的杨氏模量的分布范围均不超过20 kPa。可能是由于冬枣薄壁组织为多空隙的疏松结构，细胞间距较大。当冬枣组织处于高膨压（0.1 mol/L）时细胞吸水膨胀，细胞间隙减小，细胞壁受到较大的膨压刺激而出现胀破损伤，同时高膨压下可能使细胞壁中的果胶甲酯酶活性增加[12]，细胞壁中果胶网络遭到破坏，使得细胞壁结构发生改变，导致杨氏模量值较常压时减小。而低膨压时（0.8 mol/L），由于细胞中水分外渗，细胞间呈现分离趋势，细胞质膜收缩，微丝微管随细胞质膜收缩而弯曲，部分细微管消失，细胞膜内的大多数细胞器开始解体[2]，细胞变得柔软而富有黏性，细胞的杨氏模量下降。

图2 不同膨压水平冬枣薄壁组织杨氏模量分布图Fig.2 Distribution of young’s modulus of parenchyma of Winter jujube at different turgor levels

图3 不同膨压杨氏模量分布箱形图Fig.3 Box diagram of young’s modulus distribution at different turgor pressures

3.2 不同膨压下冬枣薄壁组织细胞表观刚度值的变化

果实在贮藏过程中，薄壁细胞膨压的改变伴随着果实的成熟软化，而细胞壁表观刚度更能直观地反映果实的软化状况[13]。植物细胞的刚度值大小主要取决于细胞壁的性质和形状，其值的大小，由力-压痕深度曲线线性部分的斜率表示。见图4，不同膨压下力-压痕曲线所示，斜率越大表示表观刚度值越大[14]。

从图5可知，低膨压（0.1 mol/L）时表观刚度较另外两种膨压处理小，平均刚度值k=（0.008±0.002）N/m；常膨压（0.45 mol/L）时，表观刚度值大于低、高膨压处理组，平均刚度值k=（0.018±0.004）N/m；而高膨压时，刚度值与常膨压相比略有下降，平均刚度值k=（0.013±0.003）N/m；这与Beauzamy 等[14]所揭示的洋葱细胞表观刚度值随溶液渗透压变化的趋势略有差异，原因可能为采用0.1 mol/L 甘露醇溶液处理时，组织细胞吸水膨胀，使得细胞处于极高的膨压下，且冬枣薄壁组织相较于洋葱表皮组织细胞的细胞壁薄，在高膨压下会出现不同程度的损伤，使得在测试时细胞的表观刚度值下降。当冬枣细胞处于高浓度的甘露醇溶液中，薄壁组织细胞处于低膨压下，此时，细胞为维持渗透平衡而失水皱缩，细胞壁与细胞质膜完全实现质壁分离，细胞壁折叠变形，细胞体积减小，微丝骨架随细胞质膜的收缩而弯曲，此时细胞壁刚度值下降但幅度较小。此外，所选取的渗透剂种类[13-15]、渗透液浓度范围[14]、AFM 压痕深度的不同[16]也可能造成结果差异。

图4 不同膨压水平冬枣薄壁组织细胞力-压痕曲线Fig.4 Cell force-indentation curve of parenchyma tissue of Winter jujube at different turgor pressure levels

3.3 不同膨压下长枣薄壁组织细胞黏附力的分布

膨压的改变，必然引起细胞黏性的变化[17]。采用AtomicJ 数据统计软件，经数据处理，自动计算生成不同膨压下的黏附力值，并绘制黏附力分布直方图。

图5 不同膨压水平冬枣薄壁组织细胞表观刚度柱形图Fig.5 Column diagram of apparent stiffness of parenchyma cells at different turgor levels

从图6a～c 可知，高膨压（0.1 mol/L）黏附力分布范围在8～750 pN，平均黏附力F=（102.06±163.55）pN；常膨压（0.45 mol/L）黏附力分布范围在30～900 pN，平均黏附力F=（178.41±141.59）pN；且高膨压、常膨压黏附力都呈正偏态分布；低膨压（0.8 mol/L）黏附力分布范围集中在40～500 pN，平均黏附力F=（187.96±76.17）pN，且呈现正态分布。

从图7可知，高膨压时，存在的异常值明显多于其它膨压处理组，而低膨压（0.8 mol/L）几乎不存在异常值；剔除异常值后，冬枣薄壁细胞的黏附力分布范围随着膨压的下降，呈现上升趋势。主要原因可能是随着甘露醇浓度升高，冬枣薄壁细胞所受膨压下降，对细胞壁的作用力减小，对细胞内的微管微丝作用力增大，而细胞骨架具有调节细胞所受应力大小、控制细胞黏附强度的特性[18]，细胞骨架与细胞壁、细胞质膜是一个连续体[19]，当细胞骨架所受应力增加时，肌动蛋白微丝开始聚集，同时应力的增加刺激了连接细胞壁与细胞质膜类整合素、钙黏素等跨膜蛋白黏附分子[2]，导致细胞壁跨膜蛋白含量增加，冬枣组织细胞壁的黏附强度增大，黏附力增加。

图6 不同膨压水平冬枣薄壁组织细胞黏附力分布图Fig.6 Distribution of cell adhesion in parenchyma of Winter jujube at different turgor pressure levels

另一方面，植物细胞壁中纤维素与半纤维素通过氢键相连形成网络，亲水性果胶和少量结构蛋白镶嵌于网络中。当冬枣薄壁细胞经渗透液处理时，渗透液浓度造成的膨压改变会引起细胞壁中果胶酶、纤维素酶含量的变化，进而使得纤维素、半纤维素、果胶的结构、含量及排列方式产生相应变化[20-21]，这必然导致细胞壁结构和组成成分的改变，细胞壁中半纤维素、果胶等多糖物质被相应酶分解析出，附着在细胞壁表面导致冬枣薄壁组织细胞在不同膨压下的黏附力差异。

图7 不同膨压水平下黏附力分布箱形图Fig.7 Box diagram of adhesion force distribution at different turgor levels

3.4 不同膨压下冬枣组织细胞杨氏模量和黏附力的差异分析

从表1中可以得出：冬枣薄壁组织细胞在常膨压（0.45 mol/L）下的杨氏模量E 平均值大于低、高膨压处理组，且杨氏模量E 值与低、高膨压的杨氏模量E 值相比有显著性差异（P<0.05）；高膨压（0.1 mol/L）时黏附力平均值与另两种膨压处理有显著性差异（P<0.05）。在低膨压（0.8 mol/L）时表现出最低的杨氏模量和最高的黏附力，而在高膨压下（0.1 mol/L）存在较高的杨氏模量和最低的黏附力，这与Rojas 等[22]通过应力松弛试验对不同膨压下甜瓜黏弹特性变化的研究结果相一致。

4 结论

本文通过不同浓度的甘露醇溶液改变冬枣组织细胞的膨压状态，利用原子力显微镜探索不同膨压下冬枣薄壁组织细胞的微观力学特性变化。研究结果如下：

1）冬枣薄壁细胞的杨氏模量随着膨压的下降表现出先上升后下降的趋势。杨氏模量E 值在常膨压（0.45 mol/L）时的分布范围较广，而在另外两组膨压处理下分布范围相差较小；表观刚度值在不同膨压状态下的大小变化与杨氏模量E 值的分布范围大小基本一致，表明冬枣薄壁细胞杨氏模量E 值的变化可以反映其刚度值的变化规律。

2）冬枣薄壁细胞的黏附力随着膨压的下降呈现增大趋势，这与细胞壁中果胶等多糖物质的降解，以及细胞中类整合素、钙黏素等跨膜黏附蛋白分子含量增加有一定的关系。

表1 不同膨压下枣组织细胞的杨氏模量和黏附力方差分析结果Table 1 Results of variance analysis of young’s modulus and adhesion force of jujube tissue cells at different turgor pressure

3）从不同膨压下杨氏模量E 和黏附力的方差分析结果中可以得出常膨压（0.45 mol/L）时杨氏模量E 值与高膨压、低膨压有显著性差异（P＜0.05）；高膨压（0.1 mol/L）时黏附力与低膨压、常膨压有显著性差异（P＜0.05）。

综上所述，不同膨压状态导致冬枣薄壁组织细胞微观力学特性差异，进而引起冬枣整果质地品质的变化，该研究可为冬枣采后贮藏保鲜提供一定理论依据。