α-三噻吩和恶喹酸混合应用对松材线虫病的防治作用*

杨耀长，张志超，王卫东，宋睿，张伟，巨云为

(1.山东省烟台市蓬莱区林业局，山东 烟台 265600；2.南京林业大学 林学院，江苏 南京 210037)

松材线虫病又称松萎蔫病，是松属(Pinus)植物的一种重要病害，其病原之一为松材线虫(Bursaphelenchusxylophilus)，属侧尾腺口纲(Secernentea)滑刃科(Aphelenchoidoidea)伞滑刃属(Bursaphelenchus)。赵博光等[1]提出松萎蔫病是由松材线虫及其体表所携带的细菌共同引起的，噻吩类杀虫剂对多种昆虫有显著的光活化毒杀作用[2-5]。α-三噻吩是噻吩类杀虫剂的典型代表，因其具有高效低毒、作用方式多样、易降解及不易产生抗性等优点[6-7]，常被用于杀灭蚊(Culexpipiens)、蝇(MuscadomesticaL.)等卫生害虫[8-9]。王建斌等[10]对α-T的杀松材线虫活性进行了测定，1×10-5g/mL和1×10-6g/mL的α-T溶液在光照强度大于1 250 Lx时，对线虫的致死率约为92%和80.5%，证实α-T具有良好的杀线虫效果。恶喹酸(OA)属于喹啉酮类杀菌剂，通过抑制细菌DNA的合成，从而阻碍细菌的分裂和增殖。Kwon等[11]通过研究杀菌剂-OA对松材线虫病的抑制作用发现，OA可以显著增强对松材线虫病的防治效果。单独注射恶喹酸的3 a生染松材线虫病黑松(Pinusthunbergii)苗的死亡率为30%，单独注射阿维菌素的染病松苗的死亡率为20%，二者混用后染病松苗的死亡率仅为10%。

因此，本文对α-三噻吩(α-terthienyl,α-T)与恶喹酸(Oxolinic Acid,OA)联合应用对松材线虫的毒杀作用及对其繁殖的影响进行研究，并研究α-T与OA的混合溶液对接种过松材线虫的黑松离体松枝的影响，以期为α-T与OA的混合溶液对松材线虫病的防治方法和作用机理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试试剂及材料

α-三噻吩(α-T)，纯度99.9%，美国Sigma公司生产，由加拿大林务局Dr.Blair Helson赠送；恶喹酸(OA)，纯度99.43%，西安万昌生物科技有限公司生产；二甲基亚砜(DMSO，分析纯)，纯度99.8%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司提供；灰葡萄孢(Botrytiscinerea)，南京林业大学林学院森保实验室提供；供试松材线虫，是由山东长岛疫区感染松材线虫病致死的黑松上分离提取，并置于南京林业大学林学院森保实验室培养。

1.2 试验仪器

TG328B型光学分析天平，内径为2.5 cm和9 cm的培养皿，计数器，250 D型恒温光照培养箱，HITACHI U-5100型光度计，夹链密封袋，15 mL塑料离心管，TG16型台式高速离心机，移液枪，诱捕器(含诱芯)，解剖刀，OLYMPUS BH 2型显微镜。其中，TG328B型光学分析天平，为上海精科天美仪器有限公司生产；250D型恒温光照培养箱，为常州金坛精达仪器制造有限公司生产；TG16型台式高速离心机，为上海卢湘仪离心机仪器有限公司生产；HITACHI U-5100型光度计和OLYMPUS BH 2型显微镜均为日本进口。

1.3 溶液配制

1.3.1 毒杀试验及离体松枝试验中溶液的配制

称取α-T 0.05 g，加入1 mL二甲基亚砜，待α-T溶解后加入约0.1 mL吐温20乳化，加蒸馏水定容至50 mL，即得浓度为1×10-3g/mL的α-T母液。分别取1、0.5、0.1、0.05、0.01 mL的 α-T母液加蒸馏水定容稀释至1 L，即得到浓度分别为1×10-6、5×10-7、1×10-7、5×10-8、1×10-8g/mL的α-T溶液各1 L。将所得溶液用锡箔纸包裹容器避光后，置于4 ℃冰箱内避光保存备用。

称取OA 0.05 g，加入蒸馏水使其充分溶解，定容至50 mL，得到浓度为1×10-3g/mL的OA母液。采用α-T母液定容稀释的同样方法，分别取部分OA母液加蒸馏水稀释，得到浓度分别为1×10-6、5×10-7、1×10-7、5×10-8、1×10-8g/mL的OA溶液。将所得溶液用锡箔纸包裹容器避光后，置于4 ℃冰箱内避光保存备用。

将浓度为1×10-3g/mL的α-T溶液和OA溶液稀释得到浓度分别为2×10-6、1×10-6、2×10-7、1×10-7、2×10-8g/mL的α-T溶液和OA溶液，将同浓度的2种溶液等量混合，得到浓度分别为1×10-6、5×10-7、1×10-7、5×10-8、1×10-8g/mL的混合溶液。将所得溶液用锡箔纸包裹容器避光后，置于4 ℃冰箱内避光保存备用。

1.3.2 α-T与OA联合应用对松材线虫繁殖影响试验中溶液的配制

分别取α-T母液和OA母液，通过稀释配制成浓度分别为5×10-8、1×10-8、5×10-9、1×10-9、5×10-10g/mL的α-T溶液和OA溶液。

将浓度为2×10-3g/mL的α-T溶液和OA溶液等量混合，得到浓度为1×10-3g/mL的混合溶液，通过稀释配制浓度分别为5×10-8、1×10-8、5×10-9、1×10-9、5×10-10g/mL的混合溶液。

1.4 试验方法

1.4.1 α-T与OA联合应用对松材线虫的毒杀试验

挑取实验室培养的松材线虫(不少于200条)，将其置于直径为3.5 cm的培养皿中，用1.3.1中配制的每个浓度溶液及自来水对照(CK)进行5组重复处理。将处理过的松材线虫置于27 ℃的恒温培养箱中，调节光照强度为450 Lx。于24 h后从恒温培养箱中取出松材线虫，在显微镜下随机挑取出200条松材线虫，观察并记录死亡线虫的数量。

各种处理的线虫死亡率=处理后死亡线虫数量/试验前线虫总虫数×100%

校正死亡率=(处理组死亡率-对照组死亡率)/(1-对照组死亡率)×100%

增长率=(α-T和OA的混合溶液作用下的校正死亡率-α-T作用下的校正死亡率)/α-T作用下的校正死亡率×100%

1.4.2 α-T与OA联合应用对松材线虫繁殖影响试验

将1.3.2配制的15种不同溶液和1个CK(共计16种处理)，分别在PDA培养基上均匀涂抹1 mL，并接种灰葡萄孢。将上述所得培养基用铝箔纸包裹避光后，置于恒温光照培养箱中培养。

取适量培养好的松材线虫用两层纱布包好，置于贝曼漏斗中，加适量的水，在常温下分离6～12 h；接取约10 mL线虫悬浮液，配制的悬浮液中线虫的密度达到20条/μL，将装有悬浮液的试管密封后置于4 ℃以下冰箱中低温保存备用。

取长满灰葡萄孢的内径为2.5 cm培养皿的培养基，以未用药剂处理的培养基为对照(CK)，每皿接种松材线虫成虫20条，雌、雄各10条。将小培养皿放入内径为9 cm的大培养皿中，用湿润滤纸保湿，并用Parafilm“M”膜封口，后放入28 ℃黑暗培养箱中培养(光强<0.1 Lx)。5 d后用贝曼漏斗法分离松材线虫并计数。由于α-T溶液和OA溶液及其混合溶液，各为5种处理，加一组自来水对照，每个处理设计为16皿，5组重复。

各处理对线虫繁殖的抑制率的计算公式为：

抑制率=(对照组线虫存活平均数-处理组线虫存活平均数)/对照组线虫存活平均数 ×100%

增长率=(α-T和OA的混合溶液作用下的抑制率-α-T作用下的抑制率)/α-T作用下的抑制率×100%

1.4.3 α-T与OA联合应用对松材线虫防治作用的离体松枝试验

选取苗圃地中树势良好的5 a生黑松，剪取生长状况良好且相似的1 a生枝条，直径在0.8～1.0 cm，长约25 cm，采集后立刻浸入自来水中备用。

去除松枝下部的松针，并剔除一部分上部松针，以减少松枝蒸腾失水。在松枝底端往上约1/3处，用解剖刀沿枝干斜切入木质部，切口深约1 mm，长约5 cm，并用锯齿在裸露的木质部刮几下，模拟天牛咬食痕，主要为防止接种的悬浮液下滑，然后将含有约500条线虫的悬浮液均匀注入切口处，这样处理可使松枝接种约500条线虫。取口径7 cm，高15 cm的玻璃瓶，加入自来水至玻璃瓶的1/2左右，将处理过的松枝放入瓶中，用聚乙烯薄膜封住瓶口。

2 d后将松枝取出，将玻璃瓶中的自来水处理干净，并分别注入浓度为1×10-6、5×10-7、1×10-7、5×10-8、1×10-8g/mL等α-T溶液和OA溶液及其混合溶液至玻璃瓶1/2，将松枝插入瓶中，每瓶1枝，以只接种松材线虫松枝+自来水为对照(CK1)，以未接种松材线虫松枝+自来水作为空白对照(CK2)，共计17种处理，每个处理设10个重复。将放入松枝的玻璃瓶用聚乙烯薄膜封住瓶口，放入可见光强度为800 Lx的恒温培养箱中进行培养。每日观察松枝的生长状况，确保玻璃瓶中的溶液充足，从发现松枝发病起记录数据直至单独接种松材线虫对照组大部分死亡。统计各种药物溶液处理下的离体松枝的枯萎数量，计算出枯萎率。根据枯萎率，判断出各种药物溶液不同浓度对松材线虫病防治效果的强弱。

校正枯萎率=(处理下松枝枯萎数量-空白对照下松枝枯萎数量)/(10-空白对照下松枝枯萎数量)×100%

校正枯萎率下降率=(α-T作用下的校正枯萎率-α-T和OA的混合溶液作用下的校正枯萎率)/α-T作用下的校正枯萎率×100%

校正枯萎率的方差分析以反正弦转换后利用SPSS 19.0软件计算。

1.4.4 毒力回归计算方法

在测算出各处理组相同药物不同试验浓度下线虫数量等相关数据后，再应用Excel进行毒力回归分析[13]，得出毒力回归方程y=b+ax，及相关系数R值、EC50值(半数有效浓度值)、死亡率和校正死亡率等相关数据。

2 结果与分析

2.1 α-T与OA联合应用对松材线虫的毒杀作用

由表1中α-T溶液试验数据可知，α-T在光照条件下对松材线虫有很好的杀灭作用，随着浓度的增加，杀灭作用逐渐增强。与CK相比，低浓度的α-T溶液仍可对松材线虫起到一定的杀灭作用。当α-T浓度≥1×10-6g/mL时，松材线虫的死亡率可达96%以上。

其毒力回归方程为：y=0.247 33x+3.411 1，R2=0.027 82，EC50≈1×10-6g/mL

由表1中OA溶液试验数据可知，OA对松材线虫本身并无明显的杀灭作用。由表1中α-T和OA混合溶液试验数据可知，同浓度的α-T与OA等量混合溶液对于松材线虫有很好的杀灭作用，杀灭作用随浓度的降低逐渐减弱。当浓度≥5×10-7g/mL时，毒杀效果可达99%以上。

其毒力回归方程为：y=-1.304 8x+14.65，R2=0.862 9，EC50≈1×10-7g/mL

由表1中α-T作用下的校正死亡率、OA作用下的校正死亡率、α-T和OA的混合作用下的校正死亡率和增长率等数据可知，不同浓度α-T和OA溶液对松材线虫均具有一定的毒杀作用，其中，α-T对松材线虫的毒杀作用随着浓度降低而减弱。OA对松材线虫没有明显的毒杀作用，但当两者混合时对α-T的毒杀效果有一定的增效作用，尤其当浓度为5×10-7g/mL时，增效作用达到最强。

表1 α-T和OA对松材线虫的毒杀作用

2.2 α-T与OA联合应用对松材线虫繁殖的抑制作用

如表2中α-T溶液试验数据所示，在黑暗条件下，α-T对松材线虫的繁殖具有非常强的抑制作用，其抑制作用随着α-T浓度的增加而逐渐增强。当α-T浓度>1×10-8g/mL时，其抑制率可达80%以上。

如表2中OA溶液试验数据所示，在黑暗条件下，OA对松材线虫的繁殖具有一定的抑制作用，但效果并不明显。随着OA溶液浓度的增加，其对松材线虫繁殖的抑制作用逐渐增强。

由表2中α-T和OA混合溶液试验数据可知，在黑暗条件下，同浓度的α-T与OA混合溶液对松材线虫的繁殖具有很强的抑制作用，其抑制率随着溶液浓度的增加而逐渐上升。当混合溶液浓度≥1×10-8g/mL时，其抑制率达80%以上；当混合溶液浓度为5×10-8g/mL时，其抑制率达92.3%。

由表2中α-T作用下的抑制率、OA作用下的抑制率、α-T和OA的混合作用下的抑制率和增长率等数据可知，α-T和OA对松材线虫的繁殖都具有一定的抑制作用，但OA的抑制作用弱于α-T。α-T、OA及其混合溶液对松材线虫的繁殖的抑制率均随着浓度的降低而下降，使用混合溶液时的抑制率高于单独使用α-T或OA。

表2 α-T和OA对松材线虫繁殖的抑制效果

2.3 α-T与OA对松材线虫病防治作用的离体松枝试验

每日观察松枝的生长状况，确保玻璃瓶中的水分充足，从发现松枝发病起记录数据直至单独接种松材线虫对照组松枝大部分枯萎死亡。在试验松枝接种线虫15 d后，部分针叶开始出现变黄现象；接种30 d后，有接种松枝枯萎死亡；在接种50 d后，CK1松枝大部分枯萎死亡，见表3。

表3 α-T和OA对松材线虫防治作用的离体松枝实验

由表3中α-T溶液试验数据可知，CK2松枝只枯萎1枝，而CK1松枝枯萎数量达到9枝，因此利用切根苗做此实验完全可行。采用其他浓度处理的松枝枯萎数量最高为4枝，最低为1枝，且随着浓度的增加枯萎数量逐渐减少。对表中校正枯萎率数据反正弦转换后进行方差分析，以线虫+5×10-7g/mLα-T溶液处理为最好，与其他处理均达极显著差异(P<0.01)。由此可知，α-T对松材线虫具有良好的防治效果。

由表3中OA溶液试验数据可知，与CK1相比，OA不同浓度处理的离体松枝枯萎数量有所减少，但相差不大。从校正枯萎率数据的方差来看，对松材线虫防治作用较好的OA溶液浓度为1×10-6g/mL，其校正枯萎率仅为55.6%，与其他浓度间差异不显著。这表明OA对松材线虫病具有一定的防治作用，但防治效果不明显，且与OA的浓度无关。

由表3中α-T和OA混合溶液试验数据可知，混合溶液对松材线虫病的防治作用很强，且低浓度的混合溶液即可很好地防治松材线虫病。随着混合溶液浓度的增加，其松枝的枯萎数量逐渐减少，方差分析结果表明，各处理与CK1间均表现出极显著的差异(P<0.01)，其中，以1×10-6g/mL混合溶液和5×10-7g/mL混合溶液效果最好，其校正枯萎率均为0。

由表3中α-T作用下的校正枯萎率、OA作用下的校正枯萎率、α-T和OA的混合作用下的校正枯萎率和枯萎率的下降率等数据可知，α-T不同浓度处理的松树枯萎率随着其浓度的增加而下降。而OA不同浓度处理的松树枯萎率低于CK1的枯萎率，说明其对松材线虫病具有一定的防治作用。当α-T与OA混合使用时，其对松材线虫病的防治效果在一定程度上得到了增强，其校正死亡率平均下降率为36.67%，防治效果明显。混合溶液对松材线虫病的防治作用随着浓度的下降而减弱，在1×10-6g/mL和5×10-7g/mL浓度时，防治效果最好。

3 结论与讨论

本研究以线虫与细菌复合致病假说为前提，从多方面测试了α-T与OA混合溶液联合毒杀松材线虫的可行性。在光照条件下，α-T对松材线虫具有良好的毒杀作用；当线虫侵入寄主体内，在无光照的条件下，α-T可抑制松材线虫的繁殖。

通过α-T 和OA联合应用对松材线虫的毒杀试验可知，在α-T溶液浓度≥1×10-6g/mL时，对松材线虫具有良好的毒杀作用。作为抗生素，OA对松材线虫的生长并无影响。将α-T和OA溶液进行混合，当混合溶液浓度≥5×10-7g/mL时，可对松材线虫起到很好的防治作用。

作为一种典型的光敏毒素，α-T在光照条件下对松材线虫具有良好的杀灭作用，王建斌等[10]采用浸渍法对α-T在可见光下对松材线虫的毒性做了测定，结果表明光强越高，α-T对松材线虫的毒性越强。但树体内有时并无阳光直射或者光照强度很弱，α-T在无光条件下是否能对松材线虫病起到很好的防治作用？本试验在无光照的条件下研究了α-T对松材线虫繁殖的影响，结果表明在无光条件下，α-T(α-T与OA的混合溶液)可明显抑制松材线虫的繁殖，从而减轻其对寄主的危害。α-T和OA对松材线虫的繁殖都具有一定的抑制作用，但OA的抑制作用弱于α-T。α-T、OA及其混合溶液对松材线虫的繁殖的抑制率均随浓度降低而下降，使用混合溶液时的抑制率高于单独使用α-T或OA。因此，α-T与OA对松材线虫防治作用的离体松枝试验在可见光下进行。另外，由于在混合溶液的配置过程中容易产生沉淀，所以要确保α-T及OA溶解完全。

通过离体松枝试验可知，α-T与OA对松材线虫病均有一定的防治作用，但α-T的防治作用更为明显。当α-T溶液浓度为1×10-6、5×10-7、1×10-7g/mL时，松枝的校正枯萎率最高仅为11.1%，最低为0。单独使用OA对松材线虫病也有一定的防治作用。作为一种杀菌剂，OA本身对松材线虫没有杀灭作用，但其可作用于线虫体表的细菌。根据赵博光等[12]提出的松萎蔫病的线虫和细菌复合侵染的假说，杀灭松材线虫体表的细菌可防止松材线虫病的发生。与单独使用α-T或者OA相比，两者混合使用对松材线虫的防治效果明显更好。α-T可直接杀灭松材线虫，OA可控制松材线虫体表的细菌，使其不能产生致萎毒素，这就是两者混合使用可增强防效之原因所在。