莲衣粉多酚提取工艺优化及体外抗氧化活性研究

刘洋坪 王建辉 刘冬敏 刘永乐 黄轶群 王发祥 李向红 俞 健

(长沙理工大学化学与食品工程学院，湖南 长沙 410114)

莲是睡莲科(Herbaceous plant)植物莲属(NelumbonuciferaGaertn)多年生水生草本植物，其成熟果实称为莲子[1]。我国是产莲大国，2018年我国莲子产量达15.48万t。目前，莲子主要经干燥、去壳(果皮)、去皮(种皮)、去芯(胚芽)等初加工后应用于食品行业。红莲机械磨皮(去种皮)过程中会产生大量莲衣粉(lotus seed peel wagte, LSPW)，又称为莲子磨皮粉、红衣粉、红皮粉或外皮粉，主要由莲衣(种皮)和部分莲子仁组成，约占莲子总质量的15%～20%，尚无有效利用途径，但其可能富含黄酮、酚酸等多酚类物质，可作为多酚的潜在来源[2-4]。

多酚提取的传统方法有索氏抽提法、浸提法和渗滤法等，新兴方法则以超声辅助法、微波辅助法、超声-微波协同辅助法、加压液体萃取法和超临界流体萃取法等为主[5]。但目前采用传统浸提法提取植物多酚仍较多[6]。对于富含淀粉的植物原料，因疏水相互作用形成的淀粉-多酚包合物会阻碍浸提溶液的有效浸入，从而降低浸提效率，而酸性溶液能够促使淀粉水解，促进多酚从淀粉-多酚包合物中溶出[7-8]。乙醇作为安全性高的有机浸提溶剂，已被广泛用于提取植物多酚[9]。研究表明，利用盐酸或乙酸-乙醇水溶液能高效浸提植物多酚，其中乙酸-乙醇水溶液浸提法更适用于食品工业[10-12]。

迄今，国内外对莲衣粉多酚提取工艺优化的研究较少。高航等[13]利用微波辅助60%乙醇提取莲衣粉多酚，仅耗时9.5 min，但其物料处理量相对较低。彭芳刚等[14]利用响应面法优化了莲衣粉原花青素的提取工艺，但使用的丙酮溶剂毒性大，且对酚酸类多酚的提取能力较弱[15]。前人研究均未考虑莲衣粉富含淀粉的物料特性，因此，本研究拟采用乙酸-乙醇水溶液浸提莲衣粉多酚，通过单因素试验及响应面Box-Behnken试验设计优化莲衣粉多酚提取工艺，测定莲衣粉多酚提取物(polyphenols extract from LSPW，PEL)的基本组成及其抗氧化活性，挖掘其抗氧化潜能，旨在为莲衣粉的开发利用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

莲衣粉，湖南宏兴隆湘莲食品有限公司，含水量为9.87%±0.03%，淀粉含量为31.48%±0.28%(干基)，其中直链淀粉占淀粉总质量的39.45%。过80目筛，于-18℃冷藏备用。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1, 2- diohenyl- 2- trinitrophenylhydrazine，DPPH)，西格玛奥德里奇公司；三吡啶三嗪(tripyridine triazine，TPTZ)，上海麦克林生化科技有限公司；亚油酸(60%～74%)，2-硫代巴比妥酸(生物试剂)，国药集团化学试剂有限公司；无水乙醇、冰乙酸、无水碳酸钠、氢氧化钠、无水乙酸钠、三氯化铁、硫酸亚铁、磷酸氢二钠、硫酸氰胺、三氯乙酸、一水合没食子酸、福林酚、苯酚、硫酸、抗坏血酸钠、磷酸二氢钠、氯化亚铁、盐酸，均为国产分析纯试剂。

1.2 仪器与设备

DZKW-4型电子恒温水浴锅，北京中兴伟业仪器有限公司；LD5-10型低速离心机，北京京立离心机有限公司；TU-1901型紫外-可见光分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司； RE-2000B型旋转蒸发器，郑州予华仪器制造有限公司；SCIENTZ-10N型冷冻干燥机、SB-5200型台式双频超声波清洗机，宁波新芝生物科技股份有限公司；AUY120型分析天平，日本岛津公司。

1.3 试验方法

1.3.1 莲衣粉多酚的测定 采用Folin酚比色法[16]，按照公式计算多酚得率：

m=C×V×d×10-6

(1)

Y=m/M×100%

(2)

式中，m为总提取液中多酚的质量，g；C为依据标准曲线计算的多酚浓度，μg·mL-1；V为总提取液体积，mL；d为总提取液的稀释倍数；M为莲衣粉的干基质量，g。

1.3.2 莲衣粉多酚提取及响应面设计

1.3.2.1 莲衣粉多酚提取工艺 按一定的液料比向莲衣粉中添加乙酸-乙醇水溶液，水浴保温，每5 min振荡混匀一次。浸提液于4 500 r·min-1离心10 min，取上清液，于4℃静置30 min，再于4 500 r·min-1二次离心10 min，取上清液，定容，测定多酚含量。

1.3.2.2 单因素试验 以乙醇浓度40%、提取温度75℃、提取时间35 min、液料比25 mL·g-1、乙酸添加量1.00 mL·100 mL-1[V乙酸:(V乙醇+V水)]为固定水平，分别考察乙醇浓度(30%、40%、50%、60%、70%)、提取温度(60、65、70、75、80℃)、提取时间(5、20、35、50、65、80 min)、液料比(15、25、35、45、55、65、75 mL·g-1)及乙酸添加量(0、0.30、1.00、1.70、2.40、3.10 mL·100mL-1)对莲衣粉多酚得率的影响，进行初步优化。

1.3.2.3 响应面Box-Behnken试验设计 根据单因素试验结果，采用Design-Expert 10软件进行三因素三水平Box-Behnken试验设计，见表1。

表1 Box-Behnken试验设计

1.3.3 莲衣粉多酚提取物的制备 将最佳提取工艺条件下的提取液于45℃旋蒸浓缩去除乙醇，经真空冷冻干燥(≤10 Pa，-46℃，48 h)，即得PEL。

1.3.4 PEL基本成分含量测定 多酚含量测定同1.3.1；总糖含量采用DNS法测定[17]；粗蛋白含量采用GB 5009.5-2016凯氏定氮法测定[18]；灰分含量按照GB 5009.4-2016测定[19]；水分含量采用GB 5009.3-2016直接干燥法测定[20]。

1.3.5 乙醇法沉淀可溶性多糖 参考杨军国等[21]的方法，稍作修改。利用70%乙醇水溶液按100 mL·g-1的液料比沉淀PEL中的可溶性多糖，240 r·min-1室温振荡2 h，再4 500 r·min-1离心10 min，上清液45℃旋蒸浓缩去除乙醇。最后将浓缩液和沉淀进行真空冷冻干燥，获得2个组分：醇溶物(70- dissolved fraction，70-DF)和沉淀(70- precipitation fraction，70-PF)。

多酚含量的测定：同1.3.1；可溶性多糖含量的测定：苯酚-硫酸法[22]。利用多酚和葡萄糖的标准曲线分别计算PEL、70-DF和70-PF中多酚和可溶性多糖的含量。

1.3.6 DPPH自由基清除能力的测定 参考Liu等[23]的方法。DPPH自由基清除率(AA)按照公式计算：

AA=[1-(As-Ab)]/Ac×100%

(3)

式中，As为2.0 mL样液+2.0 mL DPPH工作液的吸光度值；Ab为2.0 mL样液+2.0 mL无水乙醇的吸光度值；Ac为2.0 mL无水乙醇+2.0 mL DPPH工作液吸光度值。试剂空白为2.0 mL去离子水+2.0 mL无水乙醇。

1.3.7 Fe3+还原能力的测定 参考Deng等[24]的方法，稍作修改。以FeSO4为标准品作标准曲线，Fe3+还原能力以FRAP值(ferric ion reducing antioxidant power)表示，μmol·L-1Fe2+。

1.3.8 抗脂质氧化能力的测定 参考Sharma等[25]的方法，稍作修改。于试管中加入4.0 mL完全溶解的样液(1 000 μg·mL-1)、4.1 mL 2.51%亚油酸(无水乙醇配制)、8.0 mL 0.02 mol·L-1磷酸盐缓冲液(pH值7.0)、3.9 mL去离子水，混匀，水浴(45℃)避光6 d，再分别用硫氰酸铁法(ferric thiocyanate method，FTC法)(500 nm处)、硫代巴比妥酸法(thiobarbituric acid method，TBA法)(532 nm处)测定样液的抗脂质氧化能力，空白组用0.1 mL去离子水代替样液。以脂质氧化抑制率(inhibition rate of lipid oxidation，IR)表示抗脂质氧化能力，按照公式计算IR：

IR=(Ac-As)/Ac×100%

(4)

式中，Ac为空白组的吸光度值；As为样液的吸光度值。

1.4 数据分析与处理

利用Origin 9.0软件制图，SPSS 17.0软件进行统计学分析；采用Design-Expert 10软件进行响应面Box-Behnken试验数据分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 乙醇浓度对莲衣粉多酚得率的影响 由图1-A可知，随着乙醇浓度的增加，莲衣粉多酚得率先增后降(P<0.05)，乙醇浓度为40%时其得率最高(7.96%)。根据相似相溶原理，40%乙醇溶液的极性可能最接近莲衣粉多酚，使其溶解效果最佳[26]。故选用40%作为莲衣粉多酚提取的最佳乙醇浓度。

2.1.2 提取温度对莲衣粉多酚得率的影响 由图1-B可知，提取温度对莲衣粉多酚得率无显著影响(P>0.05)。当提取温度大于70℃时，莲衣粉多酚得率的增长率逐渐变小。这可能是由于随着提取温度的升高传质效率提高，虽有利于多酚浸出[27]，但由于莲衣粉富含淀粉，温度升高会伴随淀粉糊化程度加剧，导致有效浸提溶液体积减少，在一定程度上阻碍了多酚的浸出[28]。故选用70℃作为后续试验的提取温度。

2.1.3 提取时间对莲衣粉多酚得率的影响 由图1-C可知，提取时间对莲衣粉多酚得率无显著影响(P>0.05)。当提取时间大于20 min时，随提取时间的延长，多酚得率趋于平稳。说明当提取时间为20 min时，莲衣粉中的多酚与溶剂达到溶出平衡。故选用20 min作为后续试验的提取时间。

2.1.4 液料比对莲衣粉多酚得率的影响 由图1-D可知，在15～55 mL·g-1液料比范围内，随着液料比的增加，莲衣粉多酚得率显著增加(P<0.05)，当液料比大于55 mL·g-1时，莲衣粉多酚得率趋于平稳。这主要是由于液料比增大导致物料与溶剂的接触面积增加，溶质分子在固-液两相中的浓度差维持能力增强，溶质扩散速度得以提高，莲衣粉多酚得率增加。但继续增大液料比，浓度差维持能力增幅变小，溶质得率趋于平缓[29]。故选用55 mL·g-1作为莲衣粉多酚提取的最佳液料比。

2.1.5 乙酸添加量对莲衣粉多酚得率的影响 由图1-E可知，当乙酸添加量高于0.30 mL·100mL-1时，莲衣粉多酚得率先显著增加(P<0.05)，乙酸添加量达1.00 mL·100mL-1后得率再无显著差异(P>0.05)。这可能是由于添加乙酸降低了溶液的pH，有利于多酚的稳定[30]。而淀粉的酸水解则促进了莲衣粉中结合酚的释放和溶出[7]。但由于乙酸的电离度有限，最终导致莲衣粉多酚得率趋于稳定。故选用1.00 mL·100mL-1作为莲衣粉多酚提取的最佳乙酸添加量。

2.2 响应面优化试验

2.2.1 Box-Behnken试验设计方案及结果 选取乙醇浓度、液料比和乙酸添加量3个因素，按表2进行Box-Behnken试验设计，试验结果同表2所示。

表2 Box-Behnken试验设计方案及结果

2.2.2 回归方程模型的建立及显著性检验 运用Design-Expert 10软件对表2的数据进行多元二次回归拟合，得到二次回归方程模型：

Y=0.361 82A+0.234 83B+1.691 58C+0.000 13AB+0.005 4AC-0.022 86BC-0.004 66A2-0.001 74B2-0.180 61C2-5.915 20

表3 回归方程模型的方差分析及显著性检验

2.2.3 响应面分析 由图2-A、C可知，当乙酸添加量为0.30 mL·100mL-1时，莲衣粉多酚得率随液料比的增加而明显增加；当乙酸添加量≥1.00 mL·100mL-1时，莲衣粉多酚得率先随液料比的增加而明显增加，之后趋于平缓；当液料比固定为45 mL·g-1时，莲衣粉多酚得率随乙酸添加量的增加而明显增加；当液料比固定为55 mL·g-1时，莲衣粉多酚得率随乙酸添加量的增加先快速增加后缓慢变化；当液料比固定为65 mL·g-1时，莲衣粉多酚得率随乙酸添加量的增加先缓慢增加后无明显变化。这可能是由于液料比或乙酸添加量的增加能有效维持传质推动力[29]。总体上，二者对传质推动力的影响表现为：液料比>乙酸添加量。

由图2-B、C可知，BC交互作用对莲衣粉多酚得率的影响明显，该结果与模型的方差分析及显著性检验结果一致。

2.2.4 最佳提取工艺条件预测及验证试验 利用Design-Expert 10软件对模型进行预测，获得莲衣粉多酚提取工艺的最佳条件为：乙醇浓度40.508%，液料比58.868 mL·g-1，乙酸添加量1.559 mL·100 mL-1， 此条件下莲衣粉多酚得率的预测值为9.64%。为提高工艺条件的操作可行性，验证试验将响应面优化所得的各工艺参数设置为：乙醇浓度41%，液料比59 mL·g-1，乙酸添加量1.56 mL·100mL-1。 在此条件下重复试验3次，莲衣粉多酚平均得率为9.65%，与预测值的相对误差为0.10%。说明该模型预测的最佳提取工艺条件可靠。

2.3 PEL的基本组成分析

PEL的水分含量为6.42%。由表4可知，PEL的多酚、总糖含量占比最高，分别为24.03%和45.28%(干基)。这说明乙酸-乙醇水溶液在浸提出莲衣粉多酚的同时，也能高效浸提出莲衣粉中的糖类。

表4 PEL的基本组成分析

图2 Y=F(B, C)的交互作用图(A)、响应面立体图(B)及等高线图(C)

2.4 乙醇法沉淀可溶性多糖的效果

由表5可知，PEL中可溶性多糖含量为34.04%，在总糖中占比达75.18%。70-DF中可溶性多糖含量显著低于PEL，而多酚含量显著高于PEL(P<0.05)。表明70%乙醇水溶液可析出PEL中较高比例的可溶性多糖，并使得70-DF中多酚含量有所提高。

表5 PEL、70-DF和70-PF中多酚、可溶性多糖的含量比较

2.5 体外抗氧化活性及其主效成分分析

由图3可知，低浓度的维生素C(vitamin C，Vc)与DPPH自由基清除率、FRAP值存在良好的线性量效关系。PEL、70-DF清除DPPH自由基的半抑制浓度(50% inhibitory concentration，IC50)分别为0.032 和0.040 mg·mL-1，高于Vc的IC50(0.013 mg·mL-1)，但明显低于前人研究中莲衣粉乙醇提取物和甲醇提取物的IC50(0.073、0.078 mg·mL-1)[31]。表明PEL、70-DF均具有较强的DPPH自由基清除能力，但不及Vc。70-PF的IC50为0.084 mg·mL-1。 PEL、70-DF和70-PF还原Fe3+能力分别为268.6、237.68和173.19 mg AAE·g-1(以Vc的当量计)。当PEL、70-DF和70-PF的质量浓度均为1 000 μg·mL-1时，PEL的抗脂质氧化能力优于70-DF和70-PF，其对脂质氧化的抑制率为36.82%(FTC法)或59.32%(TBA法)，分别相当于TBHQ、BHA的37.12%、39.20%(FTC法)或72.92%、67.60%(TBA法)。尽管70-DF拥有较高的多酚含量，但总体上PEL的体外抗氧化活性强于70-DF和70-PF。

注：TBHQ：叔丁基对苯二酚；BHA：叔丁基羟基茴香醚。

由表6可知，多酚含量与DPPH自由基清除率、FRAP值和脂质氧化抑制率呈显著或极显著正相关，而可溶性多糖含量与抗氧化能力之间的相关性不显著。因此，推测多酚是PEL、70-DF和70-PF抗氧化的主效成分。

表6 多酚、可溶性多糖与抗氧化能力之间的相关性分析

3 讨论

植物多酚提取方法的选取一般以高效、绿色和低成本作为优选原则。林枞雨等[32]研究发现超声辅助法提取甜玉米芯多酚的效果明显优于浸提法，其提取耗时60 min，多酚得率为1.62%。郭宏垚等[33]比较不同溶剂对花椒多酚得率的影响，发现丙酮>乙醇>甲醇，但由于丙酮危险性高，最终优选乙醇作为其提取溶剂。本研究前期发现，相比于浸提法，超声辅助法提取莲衣粉多酚未能有效提高得率，考虑到绿色和低成本等因素，选用乙醇水溶液浸提莲衣粉多酚。然而，多酚的提取工艺与原料特性密切相关，酸性溶液有利于富含淀粉原料中结合酚的提取[34]。基于此，本研究最终采用乙酸-乙醇水溶液浸提莲衣粉多酚，综合运用单因素试验及响应面Box-Behnken试验设计优化得到莲衣粉多酚的最佳提取工艺为乙醇浓度41%、液料比59 mL·g-1、乙酸添加量1.56 mL·100mL-1、提取温度70℃、提取时间20 min，此条件下莲衣粉多酚得率为9.65%。受限于试验条件，本研究未能展开比较不同提取方法对提高莲衣粉多酚得率的作用效果。

植物粗提物在食品中的应用往往取决于其中的主效成分。本研究发现PEL的体外抗氧化活性强于70-DF和70-PF。PEL清除DPPH自由基的能力优于王超等[31]的莲衣粉乙醇提取物和甲醇提取物，这可能是由于PEL的水分含量明显低于莲衣粉乙醇提取物和甲醇提取物，导致PEL中的多酚含量更高。PEL还原Fe3+的能力较强，且具有优良的抗脂质氧化能力。通过抗氧化能力与多酚、可溶性多糖含量的相关性发现，PEL抗氧化的主效成分可能为多酚。有研究表明，莲衣粉多糖提取物也具有较强的抗氧化活性[35]，结合本研究可推测其抗氧化活性可能与多酚存在一定的关联。同时也表明，今后对于PEL的抗氧化活性研究仍有待进一步开展。

4 结论

本研究特征性地以乙酸-乙醇水溶液作为提取莲衣粉多酚的浸提液，结果表明，莲衣粉多酚的最佳提取工艺为：乙醇浓度41%、液料比59 mL·g-1、乙酸添加量1.56 mL·100mL-1、提取温度70℃、提取时间20 min，此条件下莲衣粉多酚得率为9.65%。PEL的多酚含量达24.03%，其清除DPPH自由基、还原Fe3+的能力较强，且具有一定的抗脂质氧化能力，有望作为食品中潜在的天然抗氧化剂。PEL中可溶性多糖含量为34.04%，但相关性分析表明其并非PEL抗氧化的主效成分，因此，可进一步研究去糖工艺来纯化PEL中的多酚，明确PEL中各多酚组分的抗氧化功效，进一步拓展其在功能性食品中的应用。