团头鲂TYK2基因的克隆与表达分析

张建，王济秀，吴晓丽，刘红

华中农业大学水产学院/农业农村部淡水生物繁育重点实验室，武汉 430070

Janus激酶/信号转导与转录因子(the Janus kinase/signal transducer and activator of transcription,JAK/STAT)信号通路是由多种细胞因子[1]、干扰素[2]、生长因子[3]和相关分子[4]介导的高度保守的信号通路，其广泛参与免疫[5]、细胞增殖[6]、生长、分化、迁移和细胞凋亡[7]等过程。JAK/STAT信号通路由3个重要因子组成，包括细胞表面的受体、JAK家族成员和STAT家族成员[8]。JAK激酶是一种非受体型络氨酸激酶，广泛存在于哺乳动物、鸟类、昆虫和鱼类[9]，在哺乳动物中，包括JAK1、JAK2、JAK3、TYK2等4个成员[10]。TYK2是JAK家族里第一个被鉴定的成员，被证明在细胞因子转导过程中起着关键作用[11]。TYK2蛋白包含4个不同的蛋白结构域：N端的B41、SH2、假激酶区和C末端的激酶区[12-13]。TYK2被证明对Ⅰ型干扰素介导的通路应答起着重要的作用[14]。在之前的小鼠模型的研究表明，除了Ⅰ型IFN和IL-12外，TYK2还对IL-6信号的转导也有重要的作用[15-16]。在缺失IFN的人类细胞系中，过表达IFN-a后，在细胞中鉴定出TYK2基因，表明TYK2是Ⅰ型干扰素信号通路的关键成分[17]。

目前，关于TYK2的研究涉及的鱼类比较少，在大西洋鲑(Salmosalar)中，过表达TYK2增强IFN诱导的Mx基因的转录水平[18]；在草鱼(Ctenopharyngodonidellus)的CIK细胞中，过表达受体CRFB5能促进TYK2蛋白的磷酸化[19]；用一定浓度的瘦素处理黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)肝脏细胞[20]和矛尾复虎虾鱼(Synechogobiushasta)[21]的肝脏细胞，都能上调细胞中TYK2基因的表达。但关于团头鲂(Megalobramaamblycephala)TYK2的研究尚未见报道。团头鲂是我国重要的淡水经济养殖鱼类。目前，由嗜水气单胞菌感染引起的细菌性败血症是团头鲂主要的病害。 笔者所在研究室在前期进行的团头鲂其他抗病基因[22-23]研究的基础上，克隆团头鲂的TYK2基因，检测其在健康团头鲂的组织分布情况和感染嗜水气单胞菌后免疫相关组织中的表达情况，旨在为深入研究TYK2在团头鲂抗嗜水气单胞菌感染过程中的分子机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验鱼与样品收集

本试验所用的团头鲂均购自湖北百容水产良种有限公司。试验所用幼鱼规格为45～55 g，健康成鱼的规格为480～520 g。将鱼运回华中农业大学水产学院实验基地暂养2周，待其适应环境后，进行试验。试验随机设置对照组和感染组2个处理，每一处理3个生物学重复。为了确定团头鲂TYK2基因的空间表达模式，分别采取健康团头鲂成鱼的心脏、肝脏、脾脏、中肾、头肾、脑、血液、肠道、肌肉和鳃等10个组织。感染试验中，用浓度为6.7 ×106cfu/mL嗜水气单胞菌对试验鱼进行腹腔注射，每尾鱼注射100 μL。对照组注射100 μL的磷酸盐缓冲液。在感染注射后的0、4、12、24、72和120 h分别采集试验组和对照组的肝脏、脾脏、中肾和肠道组织，每个时间点每个生物学重复取5尾鱼。上述所取样品立即放在液氮中冻存24 h，随后保存于-80 ℃冰箱待用。

1.2 总RNA的提取及cDNA合成

利用Trizol法提取各组织的总RNA，具体步骤参考Trizol试剂(Invitrogen)说明书。用紫外分光光度计(Nanodrop 2000，美国)测定所提取的RNA浓度，另外用琼脂糖凝胶电泳法检测RNA的完整度和纯度。将所提取的RNA按照PrimeScriptTMRT reagent Kit (TaKaRa，日本)试剂盒说明书进行反转录，获得cDNA第一条链。

1.3 序列验证和生物信息学分析

在NCBI数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov)中搜索获得斑马鱼TYK2基因的cDNA序列，通过本地Blast从实验室已有的团头鲂转录组中获取团头鲂TYK2基因的序列，用ORF Finder(www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder)分析获得其ORF序列。用Primer premier 6.0软件设计特异性引物TYK2-ORF-F/TYK2-ORF-R (表1)，以团头鲂中肾cDNA为模板，通过PCR扩增目的片段，利用DNA快速回收纯化试剂盒回收DNA片段，之后将DNA片段和Pet-32a载体在37 ℃水浴中双酶切过夜，再次利用DNA快速回收纯化试剂盒，将上述目的片段和载体回收。取2 μL目的片段和1.5 μL的Pet-32a载体进行过夜(12 h)连接，转化导入感受态DH5α中，菌液PCR验证后，送武汉擎科生物公司测序。

序列验证正确后，通过ORF Finder(www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder)预测其氨基酸序列，在线网站(web.expasy.org/protscale)分析其蛋白质的理论分子质量，在线网站SMART(smart.embl-heidelberg.de/smart)预测其蛋白质结构域，用DNAMAN软件进行TYK2蛋白质的多序列对比。最后，利用MEGA 6构建多个物种的TYK2蛋白质的系统进化树。

1.4 荧光定量PCR

为了检测TYK2基因在健康团头鲂成鱼中的组织分布情况和嗜水气单胞菌感染后在免疫相关组织中的表达变化，采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法，选择18S rRNA为内参基因，所用引物见表1。qRT-PCR反应体系为20 μL，包括SYBR混合试剂10 μL、ddH2O 7.4 μL、上下游引物各0.8 μL、cDNA模板1 μL。qRT-PCR程序为：95 ℃预变性5 min，然后95 ℃变性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共40个循环。

表1 本研究所用的引物信息Table 1 Primers used in this study

1.5 数据分析

研究中的所有数据均表示为3个独立试验样本的平均值±标准误，并使用SPSS Statistics 17.0和GraphPad 5.0软件进行数据分析及做图。采用单因素方差分析和t检验来检测数据的显著性，将P<0.05描述为统计学差异显著，P<0.01描述为统计学差异极显著。

2 结果与分析

2.1 团头鲂TYK2的序列分析

经克隆、测序验证，获得团头鲂TYK2基因的ORF全长3 489 bp，编码1 162 个氨基酸，在线网站预测其理论分子质量为131.7 ku，理论等电点为6.86。将团头鲂和斑马鱼、大西洋鲑及人等其他脊椎动物的TYK2的ORF序列与其基因组DNA序列进行比对分析，所对比物种均具有23个外显子和22个内含子，且相对应的外显子长度相似，内含子大小则差别较大(图1)。TYK2蛋白的氨基酸多序列比对结果如图2所示，团头鲂和鲤(Cyprinuscarpio)相似性最高(85.89%)，其次是草鱼(81.85%)和斑马鱼(78.71%)，最低的是小鼠(47.82%)；所有物种TYK2蛋白的磷酸化位点一致，说明其高度保守。TYK2蛋白系统进化分析如图3，鱼类的TYK2聚为一支，其中团头鲂的TYK2和草鱼的亲缘性最近，其次是鲤、斑马鱼和斑点叉尾鮰，与大黄鱼的亲缘性最远；另外，哺乳动物则聚为另外一支。

竖线段表示外显子，竖线段之间的横线段表示内含子，竖线段的宽度和横线段的长度表示核苷酸的长度。The vertical lines represent exons,the horizontal lines between them represent introns,and the width and length of the vertical and horizontal lines represent the length of the nucleotide,respectively.图1 脊椎动物TYK2基因结构图Fig.1 The structure of TYK2 genes in vertebrates

2.2 TYK2在健康团头鲂各组织中的表达

通过qRT-PCR检测TYK2基因在健康团头鲂成鱼不同组织中的分布情况，结果如图4所示。TYK2在中肾中的表达量最高，其次是血液、脾脏和头肾，在肠道、脑、鳃、心脏、肌肉和肝脏中的表达量较低。

2.3 感染嗜水气单胞菌后团头鲂TYK2的表达

感染嗜水气单胞菌后，在团头鲂脾脏中，TYK2的表达在感染后4 h极显著下调，并达到最小值(0.46倍，P<0.01)；在12 h极显著上调，并达到最大值(1.78倍，P<0.01)；之后显著下调。在中肾中，TYK2在感染后24 h极显著上调，并达到最大值(2.22倍，P<0.01)；在72 h显著下调并达到最小值(0.26倍，P<0.01)。在肠道中，TYK2在感染后4 h极显著下调表达，并达到最小值(0.42倍，P<0.01)；在12 h显著上调，并达到最大值(1.39倍，P<0.05)；在72 h和120 h极显著下调。TYK2在免疫相关组织中的表达变化表明，它可能在团头鲂感染嗜水气单胞菌后的免疫过程中发挥着一定的作用。

*间隙用短线表示。所有的氨基酸一致用灰色表示，75%一致用浅灰色表示。方框表示磷酸化位点。*Gaps are indicated by dashes. Identical amion acids are shaded in gray,and the light gray represent 75% similarity.The square marks the phosphorylation site.物种登录号：草鱼 Ctenopharyngodon idella (AMK47892.1)；斑马鱼 Danio rerio (XP_009298018.1)；大西洋鲑 Salmo salar (AGS07436.1)；半滑舌鳎 Cynoglossus semilaevis (XP_024920336.1)；黄颡鱼 Tachysurus fulvidraco (ALJ92431.1)；牙鲆Paralichthys olivaceus (XP_019950262.1)；斑点叉尾鮰 Ictalurus punctatus (XP_017310696.1)；大黄鱼 Larimichthys crocea (XP_019130882.1)；非洲爪蟾Xenopus laevis (NP_001085663.1)；原鸡 Gallus gallus (XP_025001512.1)；小鼠 Mus musculus (AAD49423.1 )；人 Homo sapiens (NP_003322.3 ).图2 团头鲂和其他脊椎动物TYK2氨基酸多序列比对Fig.2 Multiple sequence alignment of TYK2 from blunt snout bream and other vertebrate species

物种名：草鱼 Ctenopharyngodon idella，鲤 Cyprinus carpio，斑马鱼 Danio rerio,斑点叉尾鮰 Ictalurus punctatus，大西洋鲑 Salmo salar，青鳉 Oryzias latipes，大黄鱼 Larimichthys crocea，半滑舌鳎 Cynoglossus semilaevis，非洲爪蟾Xenopus laevis，原鸡 Gallus gallus，人 Homo sapiens，小鼠 Mus musculus.图3 脊椎动物TYK2蛋白的系统进化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of TYK2 in vertebrates

MK：中肾 Mid-kidney； BL：血液 Blood； S：脾脏 Spleen； HK：头肾 Head-kidney； I：肠 Intestine； B：脑 Brain； G：鳃 Gill； H：心脏 Heart； M：肌肉 Muscle； L：肝脏 Liver．柱上不同的字母表示显著性差异(P<0.05)。Different letters above pillar indicate statistically significance (P<0.05).图4 团头鲂TYK2在健康成鱼组织中的相对表达量Fig.4 Relative expression of TYK2 gene in different tissues of healthy adult blunt snout bream

3 讨 论

基因结构分析显示团头鲂TYK2基因由23个外显子和22个内含子组成，与其他几种鱼类及人等脊椎动物物种的比较发现，不同物种该基因的外显子和内含子数目相同，对应外显子的核酸数目也基本一致，但是内含子大小差异显著，说明TYK2基因在进化中高度保守[24]。该基因编码1 162个氨基酸，含有4个蛋白质结构域，B41结构域、SH2结构域、假激酶结构域和络氨酸激酶结构域[25]。经过氨基酸多序列比对分析，这些蛋白结构域在不同物种中具有高度的保守性。已有研究发现，JAK家族蛋白被细胞膜上的受体激活，使JAK家族蛋白位于激酶结构域的磷酸化位点被激活，进而激活下游蛋白[26]。在系统进化分析中，团头鲂首先与草鱼聚在一起，然后与其他鱼类聚为一支，其他脊椎动物物种则聚为另一支，与其分类地位一致。

健康团头鲂的组织表达结果显示，TYK2在中肾中的表达量最高，在其他免疫相关组织(脾脏和头肾)以及血液中表达较高，在其他组织中的表达量比较低。类似的，在其他鱼类中，鳜的TYK2在心脏、血液和免疫相关组织(鳃、脾脏、肠、中肾和头肾)中的表达量较高[26]；在大西洋鲑中，TYK2在脾脏、头肾和肌肉中高表达[18]；在黄颡鱼中，TYK2在中肾、头肾、脾脏和肠中高表达，而在肌肉中的表达较低[20]；在矛尾复虾虎鱼中，TYK2在脑、心脏和免疫组织(鳃、肠和中肾)中高表达，在肌肉中低表达[21]；有趣的是，鲤TYK2在皮肤中表达最高，其次是肠和血液，在其他免疫相关组织(脾脏、中肾和头肾)的表达较低，这种表达的差异性可能受鱼体自身及其养殖环境的影响[27]。在哺乳动物中，人的TYK2基因在淋巴组织和免疫细胞中大量表达[28]；在鸭的研究中，TYK2在组织中广泛表达，在心脏和肝脏的表达量较高，在肌肉和胃中的表达量较低[25]。在哺乳动物和鱼类中，TYK2均在免疫相关组织中高表达，表明其功能和自身的免疫过程可能有一定的关联。

*显著性差异(P<0.05) ； **极显著性差异(P<0.01)。*Statistical difference (P< 0.05) ； **Extremely statistical difference (P<0.01).图5 团头鲂TYK2基因在嗜水气单胞菌感染后的脾脏、中肾和肠道中的表达Fig.5 Relative expression of TYK2 in spleen,mid-kidney and intestine after infection of A. hydrophila in blunt snout bream

TYK2是一种非受体型络氨酸激酶，不直接参与物种的免疫过程。在物种免疫过程中，细胞因子和细胞受体结合形成三聚体将TYK2磷酸化，TYK2将下游的基因磷酸化，进而作用于免疫相关的基因[9]。

本研究中团头鲂TYK2基因在中肾、脾脏、头肾和肠的表达量较高，但感染嗜水气单胞菌后，TYK2在头肾中的表达没有显著性变化，这可能与头肾的组织特异性或者受到实验环境影响有关。感染嗜水气单胞菌后，相对于对照组，团头鲂TYK2基因在脾脏和肠道中均在4 h显著下降并达最小值，在12 h显著性上升并达最大值。在中肾中，团头鲂TYK2基因在24 h极显著性上调并达最大值，在72 h极显著性下调并达最小值。这说明TYK2在团头鲂抵抗嗜水气单胞菌的过程中起着重要的作用。在脾脏中，TYK2在24、72和120 h相对于对照组显著降低，表达恢复稳定。在中肾和肠中，相对于对照组，TYK2达到最大值后，表达仍在变化，说明TYK2可能在肠和中肾的作用时间较长。团头鲂TYK2基因在中肾中的基因表达量最大值的时间点相对于在脾脏和肠的时间点晚一些，说明中肾可能在团头鲂抗嗜水气单胞菌的过程中，作用时间稍晚。另外，团头鲂TYK2在肠道中的表达趋势与TYK2在斑点叉尾鮰的肠道中的表达趋势相似，表达相对于对照降低[29]。TYK2基因在细胞层面的研究较多，例如在缺失IFN的人类细胞系中，过表达IFN-a后，在细胞中鉴定出TYK2基因，表明TYK2是I型干扰素信号通路的关键成分[17-18]。在草鱼CIK细胞中，过表达受体CRFB5能促进TYK2蛋白的磷酸化[20]。

综上，本研究克隆获得团头鲂TYK2基因，其在进化上有较高的保守性。在健康团头鲂中，TYK2在免疫相关组织(中肾、脾脏和头肾)和血液中的表达量较高；感染嗜水气单胞菌后，在免疫相关组织(中肾、脾脏和肠)中均有显著变化。这些结果均说明团头鲂TYK2基因可能在团头鲂抗细菌感染的免疫过程中发挥着重要的作用。