聚乳酸/聚乙二醇/羟基磷灰石多孔骨支架的3D打印制备及其生物相容性

范泽文，赵新宇，邱 帅，王 艳，郭 静，权慧欣，徐兰娟

(1 大连工业大学 纺织与材料工程学院，辽宁 大连 116034;2 大连医科大学附属第一医院,辽宁 大连 116011;3 郑州大学附属郑州中心医院,郑州 450007)

骨组织生物工程支架材料可用于骨的修复和替代，能够为特定的细胞提供结构支撑，还可以作为模板引导组织再生和控制组织结构。骨组织支架材料的选择、改性和结构设计已经成为骨组织生物工程材料领域中重要的研究方向[1-3]。3D打印技术近来已被广泛用于生物医学领域[4]，其最大的优势是可利用数字化模型快速成型精准复杂的制品。多孔支架的成型可以借助3D打印技术获取适合的孔径，调控细胞在支架表面和内部的生长、增殖和分化。

聚乳酸(PLA)因其具有良好的物理、化学和生物性能，被广泛应用于组织工程支架领域，但同时存在生物活性低和韧性差等缺点，这极大限制了PLA在骨组织生物工程材料领域的应用[5-6]。Rosenzewig等[7]采用3D打印技术成功制备ABS和PLA两种生物支架，并对原代关节软骨细胞和髓核细胞在支架上的生长、生存能力和组织代谢等进行研究。除了直接对PLA进行打印外，对其改性也是研究的重点。Tiziano等[8]采用3D打印成型方法，用聚乙二醇(PEG)和具有生物活性的磷酸钙(CaP)玻璃对PLA进行改性并成功制备生物支架。结果表明，随着PEG的加入，PLA/PEG/CaP玻璃复合材料的亲水性和弹性模量会增加，而PEG含量过高会导致复合材料三维结构不均匀及力学性能的下降；体外降解研究表明，PEG的加入显著加速复合材料的降解速度，同时也改善了PLA的加工性能。

本工作通过利用PEG的两亲性、生物相容性[9]以及HA的生物活性和对PLA的增强效果[10]，通过共混改性获取力学性能改善和生物相容性好的PLA/PEG/HA复合线材，并利用熔融沉积(FDM)3D打印技术获取多孔支架。并证明了复合材料具有良好的生物相容性，为PLA复合材料在生物工程支架领域的应用提供基础数据和理论指导。

1 实验材料与方法

1.1 实验原料

聚乳酸：4032D，美国NatureWorks公司；聚乙二醇：相对分子量2000，日本青木株式会社；羟基磷灰石：5～20 μm，上海圻明生物科技有限公司。

1.2 样品制备

将PLA在80 ℃烘箱中干燥12 h后与PEG/HA(按不同比例)熔融混合挤出(转矩流变仪，Polylab QB)，包括纯PLA共6组，并牵引获得直径约为1.75 mm的线材。质量组成分别为(1)PLA：质量为200 g；(2)～(6)：PLA与PEG的质量比均为9∶1，且总质量为200 g，HA的添加量分别为0%(质量分数，下同),2%(4 g),4%(8 g),6%(12 g),8%(16 g)。试样(1)～(6)依次简称为PLA,HA0,HA2,HA4,HA6,HA8。

1.3 结构表征与性能测试

1.3.1 3D打印力学试样及多孔支架表征

根据GB/T 1040标准，利用CAD设计拉伸、冲击试样的3D打印模型和多孔支架模型，如图1(a)，(b)所示(d=14 mm，h=2 mm)。按1.2节的方法制备线材并3D打印试样。CR-10(400)型3D打印机参数及设置：喷头内径0.4 mm，温度200 ℃，底板温度40 ℃，打印层厚0.1 mm，打印速率50 mm/s，填充率100%(线性填充)；打印方向如图1(a)所示(拉伸试样平行于拉伸方向，冲击试样垂直于冲击方向)。多孔支架的打印条件不变，填充率为0。

图1 3D打印拉伸、冲击试样模型(a)和多孔支架模型(b)

1.3.2 DSC分析

分别称取一定量的PLA,HA0,HA2,HA4,HA6,HA8用作DSC(QAT-2000)测试，起始温度40 ℃，以10 ℃/min升温到200 ℃，保持3 min再以10 ℃/min降温到40 ℃，消除热历史后以10 ℃/min升到200 ℃，记录第二次升温曲线。

1.3.3 流动性分析

把挤出线材于190 ℃，10 MPa模压成直径25 mm，厚度1 mm的圆片。依靠DHR-2型旋转流变仪运动产生剪切流动来确定材料的黏性。测试条件：剪切扫描模式，温度190 ℃，剪切速率1～3500 rad·s-1。

1.3.4 支架形态及细胞黏附SEM观察

HA2复合材料线材做原料，将图1(b)的多孔支架模型实体打印出来。在JSM6460LV型扫描电子显微镜下进行形态观察。

将大鼠骨髓间充质干细胞消化后离心，重悬制备成细胞悬液后以1×105个/孔的浓度接种到支架材料表面培养24 h，室温下4%多聚甲醛固定6 h，经30%,40%,50%,70%,80%,90%,95%,100%浓度无水乙醇脱水，每一浓度脱水15 min，100%浓度脱水两次，充分干燥后于扫描电镜下观察细胞生长情况。

1.3.5 细胞骨架及细胞核的激光扫描共聚焦(LSCM)观察

将大鼠骨髓间充质干细胞消化后离心，重悬制备成细胞悬液后以1×105个/孔的浓度接种到支架材料表面培养24 h，室温下4%多聚甲醛固定30 min后分别进行鬼笔环肽和DAPI染色，清洗后于FV1000型激光共聚焦显微镜下观察。

1.3.6 力学性能测试

拉伸性能测试(Instron5900电子万能材料试验机)：将复合材料线材及3D打印(哑铃形)样条在室温下以20 mm/min的拉伸速率进行静态拉伸测试，记录材料的拉伸强度、断裂伸长率和弹性模量。

冲击性能测试(XJUY-22Z悬臂梁冲击试验机)：缺口深度2 mm，记录冲击强度。

2 结果与分析

2.1 3D打印线材的力学性能分析

3D打印线材力学性能的好坏直接影响着打印制品的质量。图2为PLA/PEG/HA复合线材的力学性能测试曲线。添加PEG后PLA的断裂伸长率由约10%提高到约18%，因为PEG可以充当PLA的增塑剂，有助于PLA分子链的伸展，并且PEG分子能进入到PLA大分子中增加PLA分子的空间体积，削弱PLA分子的相互作用力从而增加PLA韧性[11]。添加HA后断裂伸长率迅速下降，HA属无机粒子，具有小尺寸效应，它的添加会阻碍HA0分子链构象的转变，降低HA0的韧性，但有增强PLA的作用；所以复合材料在屈服之前，HA2的弹性模量要比PLA高，HA4,HA6也依然如此，HA6的弹性模量最高，比PLA高出约1 GPa。但HA8无论是拉伸强度还是弹性模量表现均较差，这可能是由于HA含量过高产生了团聚，另一个原因可能是HA可以充当PLA异相成核剂诱导其结晶[12]，并因HA含量过高可能使晶粒结晶不完善产生缺陷导致力学性能下降[13]。这与后边DSC的分析结果一致。PLA/PEG/HA线材的具体拉伸性能参数如表1所示。

图2 PLA/PEG/HA线材的拉伸性能曲线

表1 PLA/PEG/HA线材的拉伸性能

2.2 3D打印线材的热性能分析

图3 PLA/PEG/HA复合材料的DCS曲线

表2 PLA/PEG/HA复合材料的结晶参数

2.3 3D打印线材的流动性分析

线材的流动性和黏度对成型制品的好坏有直接的影响，图4为PLA/PEG/HA复合材料的流动性曲线。在低剪切频率下表观黏度(η*)基本保持不变，表现为牛顿流体特性，在高剪切频率下熔体表现为剪切变稀，为典型的假塑性非牛顿流体行为。在剪切速率较小时，PLA和HA0的η*较大，这可能是因为PLA的分子链和PEG的分子链可以形成一种拟网状的缠结结构使阻力增加导致的[17]。同时发现HA0的η*比PLA大，这可能是因为PEG分子进入到PLA大分子中增加了整个链的缠结使阻力增加所导致的。掺入HA后HA2的η*下降很多，这可能是因为在剪切过程中HA粒子可以充当润滑剂，使运动单元跃迁较为容易。对于HA4和HA6组分来说，初始η*降到最低，在410 rad/s下HA6的η*只有7.2×10-4Pa·s，而在适当的剪切速率下(8～20 rad·s-1)，HA4,HA6的熔体黏度要比PLA降低4个数量级。这除了在高剪切的作用下，HA充当润滑剂的作用也尤为明显。HA8因为HA粒子间也存在一定的摩擦力，润滑剂的作用明显下降。从而阻碍了运动单元的跃迁，所以HA8的η*不降反升。而降低PLA的η*也有助于其加工成型和3D打印成型。

图4 PLA/PEG/HA复合材料的表观黏度(η*)与剪切速率(ω)曲线

2.4 3D打印试样的力学性能分析

2.4.1 3D打印拉伸试样力学性能分析

选取4组力学性能较好的线材来做3D打印的原料，4组打印线材分别是PLA,HA0,HA4和HA6。挤出过程中发现HA8线材的流动性不好，不适合做打印线材。图5为力学试样的打印实体，观察发现其打印质量与成型精度都很高。说明挑选的线材完全可以3D打印，这为后期打印多孔支架提供了可行性保障。

图5 3D打印拉伸和冲击试样的光学图片

图6为3D打印样条拉伸测试曲线。与线材结果类似，PEG的添加增加PLA分子的空间体积，有助于PLA分子链运动，从而提高其韧性。HA虽有增强高分子材料的作用，但3D打印成型由于其增材的特性，会削弱试样的整体性，导致HA增强效果下降，不过依然保留了一定的力学性能可以满足多孔支架的基本要求。

图6 3D打印试样的拉伸性能曲线

2.4.2 3D打印冲击试样的力学性能分析

表3为3D打印成型冲击试样的测试结果。如表所示PLA的冲击强度为1.744 kJ/m2，而PEG的添加增加了PLA分子的空间体积，有助于PLA分子链的运动从而提高其韧性，使HA0冲击强度提高。然而，HA虽有增强PLA的作用，但它的添加使材料刚性增加，降低冲击强度。而且3D打印成型会使制品中存在打印结点，削弱材料的整体性；并且打印方向与冲击方向垂直，这些可能都会在一定程度上削弱PEG的增韧效果，降低HA0冲击强度。DSC和线材拉伸结果表明，PEG增韧明显，而且与PLA相容性较好，这使得即使添加HA后，冲击强度还是会得到较大的保留，依然高于纯PLA。

表3 3D打印PLA/PEG/HA复合材料的冲击性能

2.5 多孔支架的结构及生物相容性分析

组织工程支架的孔结构对细胞的黏附、迁移和增殖有重要的影响，其中孔径的尺寸在很大程度上决定着细胞能不能在支架材料中迁移和生长[18]。图7为3D打印PLA/PEG/HA复合材料多孔支架的SEM照片。图7(a)为多孔支架的表面，其孔径约为800 μm；图7(b)为它的局部表面放大图。图7(c)为多孔支架断面，其孔径约为400 μm；图7(d)为其局部断面放大图。从图7(a)～(d)可以看出3D打印多孔支架实体的孔径十分规整，打印效果好且打印精度高，这为细胞在支架材料中迁移、生长以及动物体内和体外实验的可行性提供基础保证。此外，从图7(e)～(f)能看出，支架表面存在一定的粗糙度。这对细胞的黏附、增殖、迁移和分化等也起到促进作用。

图7 PLA/PEG/HA复合材料多孔支架的SEM照片

细胞在材料表面的黏附、铺展对评价组织工程材料的性能具有相当重要的意义。图8为大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSC)在多孔支架上的黏附和标记的结果。图8(a)为大鼠BMSC在多孔支架上的黏附状况，细胞在材料表面12 h即形成了稳定的黏附，并从图8(b)可看出部分细胞开始在材料表面铺展，表明支架具有良好的生物相容性。并且通过激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope, LSCM)对大鼠BMSC在支架表面上的黏附进行观察。图8(c)为大鼠BMSC的24 h细胞骨架的荧光标记结果，图8(d)为大鼠BMSC的24 h细胞核荧光标记结果，结果显示大鼠BMSC的细胞核和细胞骨架形态良好，表明多孔支架具有良好的生物相容性且无毒性。这为PLA/PEG/HA复合材料成为骨组织工程材料提供了重要的保障，也拓宽了3D技术在定制生物支架上的应用。

图8 大鼠间充质干细胞在多孔支架上的生物相容性测试

3 结论

(1)利用熔融共混技术制备不同组分的PLA/PEG/HA复合线材，并通过分析复合材料的各种性能，筛选出适合3D打印成型的线材，并成功制备出力学性能优异的试样及生物相容性好、孔径规整的多孔支架。

(2)PEG的添加把PLA线材断裂伸长率由约10%提高到约18%，Tcc降低约18 ℃；加入HA后，PLA的弹性模量最多提高约1 GPa，Tm最多降低约7 ℃；而在适当的剪切速率下(8～20 rad·s-1)，HA4,HA6的熔体黏度要比PLA降低4个数量级。

(3)多孔支架的表面孔尺寸约为800 μm，断面孔尺寸约为400 μm；这个孔径的支架表面适合细胞的黏附、增长与分化；多孔支架与细胞12 h即形成了稳定的黏附与铺展；24 h后，细胞骨架与细胞核的形态良好，细胞生长、生存状况极佳。多孔支架的成功制备，为其在生物医学方面的应用提供了一些数据支持，为进一步发掘改性3D打印线材在生物医学方面的应用提供了可能。