酶法提取红松球果挥发油工艺研究

李勇，万道印

(黑龙江省林业科学院佳木斯分院，黑龙江 佳木斯 154000)

红松球果即松科(Pinaceae)松属(Pinus) 常绿乔木红松(Pinuskoraiensis)的松塔[1]。球果富含挥发油，其有效成分具有抗病毒、消炎、抑菌等功效，是一种有较好应用前景的天然药用资源[2]。

当前关于红松球果资源利用的研究较少，球果挥发油的提取依然沿用传统的水蒸气蒸馏法。此方法操作简单、成本低，是植物有效成分提取领域中应用最广泛的方法，但也存在着提取时间过长、效率低等弊端。酶法提取技术是近年来发展的一种植物有效成分提取新方法，其原理是利用酶破坏植物细胞壁，加速有效成分的溶出。与传统提取方法相比，此方法对设备要求不高，作用条件温和，提取效率高[3-4]。

本试验以传统水蒸气蒸馏提取法为基础，先对脱种后的红松球果进行酶解处理，加速挥发油的溶出和扩散，再进行水蒸气蒸馏提取[5]。以期既保留传统提取方法的优点，又能显著提高挥发油得率，为实际生产提供技术参考。

1 试验材料、仪器与试剂

红松球果脱种剩余物(采集自黑龙江省伊春市大箐山县带岭镇)，数显恒温水浴锅(金坛市双捷实验仪器厂)，电子调温电热套(上海邦西仪器科技有限公司)，分析天平(上海民桥精密科学仪器有限公司)，电子天平(永康五鑫恒器有限公司)，固体样品粉碎机(上海新诺仪器设备有限公司)，电热鼓风干燥箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)，台式酸度计(上海仪电科学仪器股份有限公司)，磁力搅拌器(杭州仪表电机有限公司)，挥发油测定器(泰州东方科教仪器厂)，纤维素酶(济宁和信生物技术有限公司)，果胶酶(Sigma公司)，柠檬酸(致远化学试剂有限公司)，氢氧化钠(利扬化工有限公司)，无水硫酸钠(恒兴化学试剂有限公司)。

2 试验方法

准确称取一定质量经粉碎后的红松球果脱种剩余物，分别加入适量的纤维素酶、果胶酶或其混合酶，按相应料液比加入蒸馏水，调节pH值,在一定温度下酶解适当时间后，蒸馏提取挥发油，计算挥发油得率[6]。

2.1 单因素试验

2.1.1 酶的选择。称取40 g经粉碎后的原料，调节料液比为1∶8(g/mL),pH值为4,酶解时间为2.5 h,酶解温度为45 ℃，分别加入1.1%(酶量占混合液的质量比值)的纤维素酶、果胶酶、纤维素酶和果胶酶的混合酶(质量比1∶2，1∶1，2∶1)，蒸馏提取挥发油，比较挥发油得率，确定最佳提取酶/最佳混合比例。

2.1.2 料液比的选择。称取40 g经粉碎后的原料，加入1.1%纤维素酶和果胶酶的混合酶，调节pH值为4,酶解时间为2.5 h,酶解温度为45 ℃，比较料液比为1∶5，1∶6，1∶7，1∶8，1∶9，1∶10(g/mL)时的挥发油得率，确定最佳料液比。

2.1.3 酶添加量的选择

称取40 g经粉碎后的原料，调节料液比为1∶8(g/mL),pH值为4,酶解时间为2.5 h,酶解温度为45℃，比较酶的添加量分别为0.5%、0.8%、1.1%、1.4%、1.7%、2%时的挥发油得率，确定最佳酶添加量。

2.1.4 酶解pH值的选择。称取40 g经粉碎后的原料，加入1.1%纤维素酶和果胶酶的混合酶，调节料液比为1∶8(g/mL),酶解时间为2.5 h,酶解温度为45 ℃，比较pH值分别为2.5,3,3.5,4,4.5,5,5.5时的挥发油得率，确定最佳酶解pH值。

2.1.5 酶解温度的选择。称取40 g经粉碎后的原料，加入1.1%纤维素酶和果胶酶的混合酶，调节料液比为1∶8(g/mL),pH值为4，酶解时间为2.5 h,比较酶解温度分别为30,35,40,45,50,55 ℃时的挥发油得率，确定最佳酶解温度。

2.1.6 酶解时间的选择。称取40 g经粉碎后的原料，加入1.1%纤维素酶和果胶酶的混合酶，调节料液比为1∶8(g/mL),pH值为4，酶解温度为45 ℃，比较酶解时间分别为1,1.5,2,2.5,3,3.5,4 h时的挥发油得率，确定最佳酶解时间。

2.2 正交试验

根据单因素试验结果，称取40 g经粉碎后的原料，调节料液比为1∶8(g/mL),以酶添加量，pH值，酶解温度，酶解时间为影响因素，以挥发油得率为评价指标，进行L9(34)的正交试验，进一步优化工艺。正交试验因素与水平设计见表1。

表1 正交试验因素与水平设计

3 结果与分析

3.1 酶的种类/混合比例对挥发油得率的影响

由试验结果(图1)可知，酶的加入可以提高原料的挥发油得率，加入纤维素酶和果胶酶的混合酶(质量比1∶1)得油率最高，选择纤维素酶和果胶酶的混合酶作为球果挥发油的提取酶。

图1 酶的种类/混合比例对挥发油得率的影响

植物细胞壁由纤维素、半纤维素、木质素和果胶组成。加入足量的纤维素酶和果胶酶，可以通过酶解破坏细胞结构，有助于加速油脂分子的释放溶出。纤维素酶与果胶酶之间存在着协同作用，两种酶混合使用酶解效果最佳。

3.2 料液比对挥发油得率的影响

由试验结果(图2)可知，料液比对原料的挥发油得率存在影响，当料液比为1∶8时，挥发油得率最高，确定为本试验的最佳料液比。

图2 料液比对挥发油得率的影响

料液比较低时，溶液不能充分渗入到原料中，酶和底物难以充分接触，不利于细胞结构的破坏和油脂分子的溶出；料液比较高时，酶和底物的浓度较低，酶分子与底物分子的碰撞几率降低，酶的作用效果下降。

3.3 酶添加量对挥发油得率的影响

由试验结果(图3)可知，随着酶量的增加，挥发油得率不断升高；当酶的添加量为1.4%时，原料的挥发油得率最高，确定为本试验的最佳酶添加量；当加酶量超过1.4%时，挥发油得率增长有限，趋于平稳。

图3 酶添加量对挥发油得率的影响

酶添加量是影响挥发油提取的重要因素之一。酶添加量不足，酶解反应不完全；随着酶浓度的增加，酶解反应越发充分；酶添加量过多，造成浪费的同时甚至可能影响挥发油品质。

3.4 酶解pH值对挥发油得率的影响

由试验结果(图4)可知，随着pH值的增加，原料的挥发油得率逐渐增加；当pH值为4.5时，挥发油得率最高，确定为本试验的最佳pH值；pH值继续增大，挥发油得率下降。

图4 酶解pH值对挥发油得率的影响

酶的活性受pH值的影响，酶在最适pH值时拥有最高的酶活，偏离其最适pH值，酶活下降，酶解效果不佳。

3.5 酶解温度对挥发油得率的影响

由试验结果(图5)可知，随着酶解温度的升高，原料的挥发油得率逐渐增加；当酶解温度为45 ℃时，挥发油得率最高，确定为本实验的最佳酶解温度；继续升高温度，挥发油得率呈下降趋势。

图5 酶解温度对挥发油得率的影响

温度是影响酶活性的重要因素之一。酶在最适温度环境中活性最高，酶解反应速率最快。低温会抑制酶的活性，过高的温度会使酶失活。

3.6 酶解时间对挥发油得率的影响

由试验结果(图6)可知，随着酶解时间的增加，挥发油得率逐渐增加；当酶解时间为3h时，挥发油得率最高，确定为本实验的最佳酶解时间；继续延长酶解时间，挥发油得率增长有限，趋于平稳。

酶解反应需要一定的时间，酶与底物充分接触，有利于植物细胞壁的破坏，加速油脂的释放溶出。

图6 酶解时间对挥发油得率的影响

3.7 正交试验结果

由试验结果(表2)可知，4个因素对挥发油得率影响的主次顺序为A>B>D>C，即酶添加量>pH值>酶解时间>酶解温度；优化的最佳组合为A3B2C2D3，即酶添加量1.7%、酶解pH值为4.5、酶解温度45 ℃、酶解时间3.5 h。

表2 正交试验结果与分析

将优化的最佳组合A3B2C2D3与(表2)中的最优组合A3B2C1D3进行对比验证试验(见表3)。

表3 验证试验

由试验结果(表3)可知，最佳提取工艺条件为A3B2C2D3：酶添加量1.7%，酶解pH为4.5，酶解温度45 ℃，酶解时间3.5 h。

4 结论

本试验以红松球果脱种剩余物为原料，经粉碎、酶解、水蒸气蒸馏提取挥发油，通过单因素试验和正交试验，确定最佳提取工艺条件为：选用纤维素酶和果胶酶的混合酶(质量比1∶1)，料液比1∶8，酶添加量1.7%，酶解pH为4.5，酶解温度45 ℃，酶解时间3.5 h，在此工艺条件下，挥发油得率为1.775%。此提取方法操作简单易行，对设备要求不高，工艺运行成本低，综合效益显著。