蔬菜中萝卜硫素的质谱测定方法

李东芹

摘要 [目的]建立萝卜硫素的液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）快速测定方法。[方法]采用Acquity UPLC BEH Amide（150 mm×2.1 mm，1.7 μm）色谱柱进行色谱分离，流动相为含0.04%乙酸的乙腈与0.04%乙酸水溶液梯度洗脱12 min，流速为0.2 mL/min;在质谱正离子模式下用多反应离子监测（MRM）模式来进行定量测定。[结果]萝卜硫素在9.7～310.0 μg/L线性关系良好（r=0.999 5），回收率为74.2%～124.2%，RSD为1.35%～7.19%;测定结果重复性好，RSD为2.93%;方法的定量限为0.002 5 μg/L（S/N=10），检出限为0.001 2 μg/L（S/N=5）。[结论]该方法灵敏度高、选择性好，适用于蔬菜遗传育种、营养和药用价值开发研究中萝卜硫素的快速测定。

关键词 液相色谱-串联质谱法;萝卜硫素;西兰花;花椰菜

Abstract [Objective]A rapid high performance liquid chromatography-mass spectrometry （HPLC-MS/MS） method was developed for the determination of sulforaphane in the vegetables.[Method]The HPLC separation was carried on the Acquity UPLC BEH Amide column （150 mm×2.1 mm，1.7 μm） with methanol and 0.1% acetum buffer eluting gradiently in 12 min.The total flow rate was 0.3 mL/min.The sulforaphane was detected by using multiple reaction monitoring （MRM） in ESI positive mode of mass spectrometer.[Result]There was a good linear relationship within the range of 9.7-310.0 μg/L（r=0.999 5）.The recovery rate was 74.2%-124.2%，the RSD was 1.35%-7.19%; the repeatability of the measurement results was good，the RSD was 2.93%.The limit of quantification of the method was 0.002 5 μg/L （S/N=10），and the limit of detection was 0.001 2 μg/L （S/N=5）.[Conclusion]This method has high sensitivity and good selectivity，and is suitable for rapid determination of sulforaphane in vegetable genetic breeding，nutrition and medicinal value development research.

Key words High performance liquid chromatography-mass spectrometry（ HPLC-MS/MS）; Sulforaphane; Broccoli;Cauliflower

萝卜硫素的化学名称为1-异硫氰酸-4-甲磺酰基丁烷。现有研究证明，它不仅对结肠癌、皮肤癌、乳腺癌等有明显的阻断作用[1-3]，还可以抑制甲型流感病毒复制[4]及保护中枢神经系统等[5]。因萝卜硫素的化学合成需要大量有毒试剂且过程不可控，其主要来源还是从蔬菜中提取，所以建立萝卜硫素的测定方法对其开发利用具有非常重要的意义。西兰花、紫甘蓝和花椰菜等十字花科的蔬菜中含有非常丰富的萝卜硫素。现有的蔬菜中萝卜硫素的研究主要集中在酶解方法[6-7]、提取和纯化工艺方面[8-14]，其定量分析方法研究的很少且主要为液相色谱方法[15-18]。随着分析仪器的飞速发展，质谱以其高灵敏度、高选择性的优点而被广泛应用，如孔兰等[19-20]用气相色谱质谱分析西兰花中的挥发性组分，馬帅等[21]利用液相色谱质谱分析西兰花和花椰菜中23种酚酸类物质。蜂蜜、花粉等物质中萝卜硫素的液相色谱质谱检测有少量报道[22-25]，但其在蔬菜中的检测应用鲜见报道。该试验建立了蔬菜中萝卜硫素的液相色谱质谱分析方法，以期为蔬菜育种、营养及药用价值开发研究中萝卜硫素的快速测定提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 仪器。4000 Qtrap 串联三重四级杆线性离子阱质谱仪（美国AB Sciex公司）; LC-30AD高效液相色谱仪（日本Shimadzu公司）;Milli-pore 超纯水仪（美国Millipore公司）;超声波（宁波新芝）;1/10 000天平（梅特勒公司）;蠕动泵（Hamilton 公司）。

1.1.2 试剂。乙腈（色谱纯，默克公司）;超纯水;萝卜硫素（≥98%，LC_MS级别，成都克洛玛生物科技公司）;甲酸和乙酸（默克，色谱纯）;1 mL医用注射器（上海安普）;0.22 μm微孔滤头（津腾，尼龙66进口）。

1.1.3 试材。西兰花、花椰菜均为华中农业大学市场采购。

1.2 试验方法

1.2.1 样品制备。

因为质谱仪不能使用非挥发性酸及盐类物质，参考文献[4]和[26]，对萝卜硫素的提取方法进行改良。将新鲜蔬菜切成2 mm左右的小块，精确称量1 g左右样品（每个样品2个重复）放置于50 mL的离心管，加入 5 mL 正己烷超声5 min脱脂，重复操作2次后将正己烷挥发至干。加入5 mL pH为5左右的甲酸水溶液，超声水解5 min。加入20 mL乙酸乙酯，超声萃取30 min，加入过量的无水硫酸钠干燥处理，以4 000 r/min离心5 min，取200 μL上清于1.5 mL离心管内，通风橱内室温挥发至干。提取物用1 000 μL 30%的乙腈水溶液复溶，经0.22 μm微孔滤头过滤后上机测试。

1.2.2 仪器条件。

1.2.2.1 色谱条件。Acquity UPLC BEH Amide（150 mm×2.1 mm，1.7 μm）色谱柱，样品室温度为室温;流动相：A为0.1%乙酸水溶液，B为含0.1%乙酸的乙腈溶液;流速为0.2 mL/min，柱温箱温度为40 ℃，进样量为5 μL。梯度洗脱条件为：B∶A，0 min 为 5∶95（V/V），5 min 为 80∶50 （V/V），5.1 min为100∶0 （V/V），8.1 min为5∶95 （V/V），12 min程序结束。

1.2.2.2 质谱条件。采用电喷雾（ESI）离子源，在正离子电离模式下选用多反应离子监测（MRM）扫描模式进行定量分析。电喷雾电压5 500 V;离子源温度500 ℃;离子源辅助气GS1/GS2气流均为50 L/h。

2 结果与分析

2.1 质谱参数优化

浓度155 μg/L的萝卜硫素标准溶液用蠕动泵直接进质谱仪进行Q1扫描，在ESI+ 电离模式下得到萝卜硫素的[M+H]+为 178.2的母离子，ESI- 电离模式下萝卜硫素的母离子176.2信号很弱，因此选用ESI+ 电离模式;再选用子离子扫描模式，一定碰撞能量下将母离子打碎，得到萝卜硫素的二级质谱图（图1）;继续对去簇电压（DP）、入口电压（EP）、碰撞能量（CE）和碰撞出口电压（CXP）等质谱参数进行优化，在DP为75 V、EP为8 V、CE为18 V、CXP为6 V 条件下，萝卜硫素的母离子、子离子信号强度比例适中，灵敏度最高。选取丰度最大的子离子作为定量子离子对（178.2/114.1）、丰度次强的子离子作为参考离子对（178.2/119.3）进行定量测定。

2.2 色谱分离条件优化 用浓度为38.75 μg/L的萝卜硫素标准溶液，单因素试验比较岛津VP-ODS C18（150 mm×2.0 mm，5 μm）色谱柱和Acquity UPLC BEH Amide（150 mm×2.1 mm，1.7 μm）色谱柱，甲醇-水和乙腈-水组合的分离效果，发现Acquity UPLC BEH Amide色谱柱峰型较好，乙腈-水体系洗脱信号强度较高;用Acquity UPLC BEH Amide色谱柱和乙腈-水体系，试验不同梯度洗脱程序，最终确定“1.2.2”的色谱分离条件。

2.3 样品前处理方法的优化

影响蔬菜中萝卜硫素萃取效果的3个关键因素为水解时间、萃取试剂和萃取时间。该研究用单因素试验分别考察水解时间（1、2、3、4、5 h）、萃取试剂（二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮）和超声萃取时间（15、30、45、60、75 min）对萝卜硫素萃取率的影响，结果显示，水解时间对萃取效率几乎没影响;二氯甲烷效果最好，丙酮最差，考虑到试剂的毒性和环境污染，选择效果居中的乙酸乙酯作溶剂;超声萃取时间对萃取率的影响是先随时间增长升高再缓慢下降（图2），综上选用“1.2.1”的样品处理方法。

2.4 方法学考察

2.4.1 标准曲线的绘制。

精确称取萝卜硫素标准品6.2 mg，用30%的乙腈水溶液溶解定容至100 mL容量瓶，得到62 mg/L 的萝卜硫素标准储备液。用30%乙腈水溶液逐步稀释为310.00、155.00、77.50、38.75、19.40、9.70、0.97、0.49 μg/L 梯度标准溶液。在“1.2.2”仪器条件下上机分析。以标准溶液的浓度为横坐标（x）、相应的萝卜硫素峰面积为纵坐标（y），绘制标准曲线。结果显示（图3），萝卜硫素在9.7～310.0 μg/L线性关系良好，线性方程为y=1.6E+004x +1.11E+005 （r=0.999 9）。

2.4.2 方法的检出限和定量限。将标准溶液连续稀释后上机分析，以目标峰信噪比（S/N）为10和5，确定方法的定量限和检出限分别为0.002 5和 0.001 2 μg/L。

2.4.3 精密度试验。

将精确濃度为38.75 μg/L 的萝卜硫素标准溶液重复进样5次，检测结果平均值为38.5 μg/L，RSD为2.93%。

2.4.4 回收率试验。

新鲜西兰花中萝卜硫素含量在1～6 μg/g，所以选择1.55 、3.10、6.20 μg/g 浓度水平的添加。同样条件下，萝卜硫素的萃取率也会有一定波动，因此在加标回收试验同时做一份对照样品。精确称取1 g西兰花的花蕾10份，分别添加1.55、3.10、6.20 μg 标准样品（每个质量水平3份），按“1.2.1”的方法前处理后上机分析。 经计算（表1），萝卜硫素3个质量水平添加的回收率为74.2%～124.2%，RSD为1.35%～7.19%。

2.5 实际样品检测

分别精确称取花椰菜的花和茎、西兰花的花、茎、叶1 g左右（2个重复），经“1.2.1”方法处理后，在“1.2.2”仪器条件下上机测试，由外标标准曲线定量计算，萝卜硫素在新鲜花椰菜的花和茎中含量分别为2.2 和1.7 μg/g ，在西兰花的花、茎、叶中的含量分别为5.8、3.2 和12.0 μg/g。这里西兰花叶片中萝卜硫素含量比花中高是因为叶片的含水量非常低的缘故。

3 结论

该研究建立的萝卜硫素液相色谱质谱测定方法，前处理简单、分析时间短，其高灵敏、高选择性的特点能有效避免液相色谱法中杂质干扰问题，可普遍适用于各种蔬菜中萝卜硫素的快速测定，不仅可为蔬菜的育种研究、营养及药用价值开发研究提供技术支持，还可为人们日常膳食营养搭配和食疗保健提供理论指导。

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