奶牛阴道菌群的多样性与产后子宫内膜炎的相关性研究

姚鑫鑫 吴春阳 李志明

摘要 [目的]探讨奶牛阴道菌群的多样性与奶牛产后子宫内膜炎发病之间的关联性。[方法]随机采集30头牛的阴道分泌物，对其分泌物进行16S rDNA测序，将测序的数据进行除杂等处理后，使用UPARSE软件对不同样本细菌的丰度及多样性进行分析，记录所采集的30个样本产后子宫内膜炎的发病情况。[结果]4头奶牛产后患有子宫内膜炎，发病率为13.33%。不同样本的阴道菌群差异显著但在患病样本中却有一定的相似性。产前阴道菌群的OTU（operational taxonomic unit）个数均在100以上且丰度也较大，且菌群中多以短小芽孢杆菌（Bacillus_pumilus）为主的奶牛产后易患子宫内膜炎。[结论]奶牛产前阴道菌群的多样性变化可为产后子宫内膜炎的发病提供早期预警，对奶牛子宫内膜炎的防治具有一定的参考价值。

关键词 16S rDNA测序技术;子宫内膜炎;奶牛;阴道菌群

Abstract [Objective]To investigate the correlation between the diversity of vaginal microflora and the incidence of postpartum endometritis in dairy cows. [Method]The vaginal secretions of 30 cattle were randomly collected， and 16S rDNA sequencing was made on the secretions. After impurity removal and other processing， UPARSE software was used to analyze the abundance and diversity of bacteria in different samples， and the incidence of postpartum endometritis in 30 samples collected was recorded.[Result]The incidence of endometritis postpartum was found in four cows，the incidence rate reached 13.33%. Although the difference of vaginal microflora in different samples was significant， but there were some similarities in the diseased samples.The amount of OTU （operational taxonomic unit） of prenatal vaginal flora was more than 100， and its abundance was also large.Moreover， most cows with Bacillus pumilus as their main species were prone to suffer from postpartum endometritis.[Conclusion]The diversified changes of prenatal vaginal microflora in dairy cows could provide early warning for the incidence of postpartum endometritis， which had certain reference values for the prevention and treatment of dairy cows endometritis.

Key words 16S rDNA sequencing technology;Endometritis;Dairy cow;Vaginal flora

子宫内膜炎是奶牛产后经常发生的一种群发普通病，主要以子宫内膜发生炎症、阴道流出污浊或黏性分泌物为特征，给养殖业造成了很大的经济损失[1]。据报道，子宫内膜炎的发病率约占英国不孕牛的95%[2]。许多奶牛发生不孕症的原因大部分是由于患有子宫内膜炎。据统计，我国奶牛与其他品种牛相比更容易发生与繁殖障碍相关的疾病，发病率为15%～20%。在患有不孕症的牛中，子宫内膜炎所引起的不孕症占50.62%[3-4]。奶牛患病后，病情较轻者与健康牛相比休情期明显延长，影响繁殖与配种，进而影响泌乳量，病情较重者会造成繁殖能力丧失[5]。动物菌群与动物健康间的关系一直以来是科学家们广泛关注的热点和研究方向。近年来，有研究人员发现，奶牛阴道菌群失衡是导致其发病的根本因素。在生殖道内的特定部位微生物种类繁多，这些微生物与环境和宿主间互相保持平衡并维持其生殖系统的正常生理功能，认清这三者之间的关系直接关系到各种疾病的发生、发展和治疗[6-7]。研究发现，感染HR-HPV的女性阴道菌群结构与未感染的女性明显不同。前者具有明显增加的物种多样性，主要表现为乳酸杆菌的减少和阴道加德纳菌的增加[8]。 HSV-2阴道感染的雌性小鼠同样表现出显著的微生物变化[9]。宫颈样品中的微生物群成为检测子宫内膜异位症患病风险的指标[10]。奶牛子宫内细菌感染是一个高度动态的过程，细菌种类遵循特定的进展模式[11]。然而，子宫菌群在子宫疾病发展中的潜在作用需要进一步的研究来阐明。笔者选用16S rDNA方法，对奶牛阴道菌群的组成及其多样性进行了分析，并对其与产后子宫内膜炎发病率之间的相关性进行研究，从阴道菌群的角度探究奶牛产后子宫内膜炎发生的早期预警，旨在為子宫内膜炎的预防、诊断和治疗提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料。

从北京市平谷区顺阳光农场采集了30头荷斯坦牛的阴道分泌物，同时跟踪记录其人工输精、妊娠、分娩以及产后患子宫内膜炎情况。

1.1.2 主要试剂。

CTAB（自配）、HiFi Hot Start Ready Mix（Kapa，KK2501）、Qubit dsDNA Assay Kit（Life Technologies，Q328520）。

1.1.3 仪器与耗材。

PCR扩增仪（Bio-rad，580BR10905）、超净工作台、水平电泳仪（Tanon，HE-120）、微量移液器（Eppendorf）、Bioanalyzer（Aglient，2100）、离心管（Axygen）、高速离心机（Eppendorf，Centrifuge 5418）、凝胶成像分析仪（Tanon 2500）。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA的提取。

试验采用DNA试剂盒，根据说明书步骤提取样本的基因组DNA，将提取的DNA通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度。取提取的样品适量置于离心管中，将其稀释至浓度1 ng/μL，备用。

1.2.2 PCR扩增。

以稀释后的样品为模板，根据选择的对应测序区域，引物选用带Barcode的特异引物，酶选择KAPA公司的高保真酶（HiFi Hot Start Ready Mix），点样混匀后进行PCR扩增。鉴定细菌多样性对应区域为16S V3～V4 区（引物为343F和798R，如表1所示），若为其他区域请将区域及引物进行替换。

1.2.3 PCR产物的纯化。

采用琼脂糖凝胶电泳法检测PCR产物，然后使用磁珠纯化，继续进行二轮PCR扩增。接着重复上述纯化步骤，将最后的PCR产物Qubit定量后上机测序。

1.2.4 菌群的多样性分析。

使用Trimmomatic软件对原始双端测序数据进行去杂，目的是去掉模糊碱基和低质量碱基，进一步提高拼接率[12]。将去杂后的双端数据进行拼接进行后续分析，拼接使用FLASH 1.2.11软件[13]进行，并对拼接后的reads数据进行统计。随后进一步进行去杂，将获取的序列进行去嵌合体序列处理。进行一系列步骤后得到较优质的序列，以便进行下游分析。

使用Uparse[14]软件进行OTU划分，其相似度为97%。然后从各OTU中挑选丰度最大的序列作为代表。与Silva-16S数据库[15]（默认使用Silva-16S数据库[16]）进行比对，用最终得到的数据构建系统发育树和OTU分类表格，然后进行α和β多样性分析。

将以上OTUs聚类分析结果不同样品之间共有和特有的OTUs进行分类及分析，绘制出花瓣图。

挑选出各个OTUs的代表序列后，根据序列比对，使用pynast[17]软件对挑选出的OTUs代表序列进行系统进化关系的构建，生成进化树，最后统计出各个OTUs的丰度，挑选出reads最多的TOP100的OTUs，构建进化树，对应OTUs在不同样本中的丰度，分析不同物种之间的进化关系。根据分类的OTU结果以及各个OTUs的丰度（reads数目），进行OTU的Heatmap 绘制，Heatmap 中的颜色表示一个OTU或分类所包括的序列数目水平（reads），红色表示高水平，蓝色表示低水平，数字表示某个样品中分类所包括的序列数目。

根据样本中各个物种的比例绘制图形，以柱状图和面积图的形式表现。柱状图以及面积图中面积较大的物种为较优势物种。

多样性分析以PCoA（principal co-ordinates analysis）和NMDS（nonmetric multidimensional scaling）进行。将PCoA中的特征向量和特征值进行排序，以便于观察个体、群体间的差异。 NMDS可以展示比对样本组之间的差异。

最后，采用随机重复抽样算法对UPGMA的可靠性进行分析。Jackknifed重复抽样UPGMA 树状图可用来与整个数据集分析生成的UPGMA图进行对比，最终得到一个支持结果及树状图，用以观察样本的相似性。

2 结果与分析

2.1 宫内膜炎发病情况

由表2可知，采集于北京平谷地区顺阳光农场的30头奶牛中，序号S3、S13、S14、S20的奶牛人工输精后产后患有子宫内膜炎，发病率为13.33%。

2.2 不同样本阴道菌群的OTU分析

从图1可以看出，产后患子宫内膜炎的S3样本中特有的OTUs个数为422个，S13特有的OTUs个数为849个，S14特有的OTUs个数为193个，S20特有的OUTs个数为100个。产后未患子宫内膜炎的样本牛中特有的OTUs个数普遍低于100个，个别样本特有的OTUs个数大于100个，但远低于S3和S13中的特有的OTUs个数。

通过观察基于OTU绘制的系统进化树发现，S3和S13样本中感染细菌的丰度显著高于其他样本，其他样本的细菌丰度差异不大（图2）。

从基于丰度绘制的样本细菌种群结构分布可以看出，S3样本中以短小芽孢杆菌（Bacillus_pumilus）、蔬菜芽孢杆菌（Bacillus_oleronius）和链霉菌（Streptomyces_sp._KP17）为主。S13样本中以短小芽孢杆菌（Bacillus_pumilus）和乳酸链球菌（Lactococcus_lactis）为主。S14主要以环状芽孢杆菌（Bacillus_circulans）和短小芽孢杆菌（Bacillus_pumilus）为主。S20主要以多动物链球菌（Streptomyces_pluranimalium）、环状芽孢杆菌（Bacillus_circulans）和短小芽孢桿菌（Bacillus_pumilus）为主（图3）。

根据分类的OTU结果以及各个OTUs的丰度，进行OTU的Heatmap绘制，结果如图4所示，北京市平谷区顺阳光农场奶牛阴道菌群中主要以芽孢杆菌为主，其中以蜡样芽孢杆菌（Bacillus_cereus）为主的奶牛产后普遍没有患子宫内膜炎，而以短小芽孢杆菌为主的奶牛患子宫内膜炎的概率大大增加，也不排除其他条件性致病菌在特殊情况下引起的奶牛子宫内膜炎。

2.3 β多样性分析结果

通过多样性分析结果可以发现各个样本的菌落组成差异比较显著。

采取随机重复抽样算法对UPGMA的可靠性进行分析。Jackknifed重复抽样UPGMA树状图可用来与整个数据集分析生成的UPGMA图进行对比，最终得到一个支持结果以及树状图。结果显示，S3和S13以及S14样本具有一定的菌落相似性，S20样本完全独立于另外3个患产后子宫内膜炎的样本（图5）。

3 讨论

奶牛阴道正常菌群的形成是机体和环境相互适应的结果，菌群、动物机体和环境三者之间存在一种动态平衡关系，由于各种因素均可轻易破坏奶牛阴道菌群，因此奶牛阴道菌群的研究是一个亟待解决的问题[18-19]。但随着各项技术的发展及深入，基因检测技术的出现加快了奶牛阴道菌群研究的进展。其中，Illumina MiSeq高通量测序技术是目前用于研究奶牛阴道微生物多样性的重要手段及先进技术[20]。

Illumina MiSeq技术试验结果数据量大、准确率相对较高，得到并鉴定的细菌类型多，有利于奶牛阴道内许多低丰度菌属和未知细菌的发现，因此被广泛用来进行各种微生物致病菌的分离和鉴定[21]。相关研究人员用16Sr DNA测序的方法，发现健康牛子宫细菌以Firmicutes和Bacteroidetes为主[22]。彭宇[23]将分娩后10、20、30、40 d的奶牛样本分别进行基因提取、扩增和测序，将V6～V8为目标片段区域进行DGGE分析并进行测序，结果表明分娩后10 d的未患病奶牛阴道内的主要细菌为Bacteroides和Porphyromonas;40 d健康奶牛阴道内的主要细菌为Tenericutes。Santos等[24]将患有子宫炎的奶牛样品进行对比，利用PCR-DGGE方法，结果发现未患病奶牛阴道的优势菌为Gammaproteobacteria和Tenericutes。该研究对阴道微生物测序时亦采用16S rDNA测序法，将V3～V4区作为靶目标测序片段，运用Illumina MiSeq技术将30头奶牛阴道标本进行检测菌群分析。结果发现，产前阴道菌群的OTU（operational taxonomic unit）个数较多且均在100以上且丰度也较大，菌群中多以短小芽孢杆菌（Bacillus_pumilus）为主的奶牛产后易患子宫内膜炎。通过不同样本的OTU分析发现，未患病奶牛阴道菌群与患病奶牛阴道菌群对比，前者OTU个数较少，而后者OTU个数相对较多，患病样本S3和S13的细菌丰度最显著，但S14和S20样本的细菌丰度与其他未患病样本差异不大。研究表明，在产后第7天患子宫内膜炎母牛的拟杆菌含量较高。在产后发热的奶牛、初产奶牛、有辅助分娩的奶牛和生双胞胎的奶牛中，富集细菌和拟杆菌的负荷也更高。微生物群组成和总细菌载量与子宫疾病和生殖衰竭的已知围产期危险因素有关[25]。人因子宫良性疾病（如子宫肌瘤、子宫内膜炎、输卵管炎等），除外生殖道感染后需行手术治疗患者，从患者阴道、宫颈管及直肠子宫陷凹等处收集抽吸液，进行16S rDNA 测序，结果显示患者生殖道的微生物菌群随着定植部位的改变而变化，下生殖道仍以乳酸杆菌为绝对优势菌群，随着生殖道的上行宫腔、输卵管、道格拉斯腔液，乳酸杆菌在各部位的丰度逐渐下降，相反地，假单胞菌（Pseudomonas）和鲍氏不动杆菌（Acinetobacte）丰度逐渐增加[26]。宫腔菌群的改变引起了子宫内膜炎症反应机制的改变，释放多种炎性物质，促进慢性子宫内膜炎等疾病的发生和发展及恶变的危险因素[27]。研究显示，健康Gttingen 迷你猪阴道菌群的优势菌门主要富集厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门、放线菌门和梭杆菌门5个门。患有子宫内膜炎的母猪，变形菌门占比显著增加，该门包含有大量的大肠杆菌和志贺氏杆菌等致病菌[28]。除变形菌门以外，其余4个健康组的优势菌门在患病后相对丰度均呈现相应降低[29]。

北京市平谷区顺阳光农场30头牛中仅有4头牛产后患有子宫内膜炎，整体发病率为13.33%。这30头奶牛阴道菌群的组成无论产后是否患子宫内膜炎，其菌落组成差异均显著，说明菌落组成与产后患子宫内膜炎没有必然的联系。然而，通过比较各个样本的相似性发现S3、S14、S13样本相似性较大，说明该相似样本患产后子宫内膜炎的风险较大。但S20样本却完全独立于另外3个患病样本。因此，不能忽視其他组样本菌落的组成差异，同样有患子宫内膜炎的风险。

总而言之，奶牛产后子宫内膜炎患病因素很多，阴道菌群组成复杂，阴道菌群间组成差异与产后奶牛子宫内膜炎的发病之间没有必然联系，仅具有一定的指示作用，要综合考虑各个方面因素，才能有效防治奶牛产后子宫内膜炎的发生。

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