肉牛肝脏miR-23a的靶基因及生物学功能预测

（黑龙江八一农垦大学，黑龙江 大庆 163319）

运输对畜牧业是一种常见的应激源，当动物处于一系列负面刺激，如振动、噪声、环境的变化等因素，都可能导致应激的发生，进而影响动物的生产性能[1]。运输引起的应激已经成为危害肉牛生产性能的重要元素之一。在应激发生的过程中，机体的多种生物系统会响应应激反应。研究表明，miRNAs与多种应激反应密切相关[2]。在应激发生时，机体内多种系统会作出反应，来抵抗应激带来的不良影响，其中，miRNAs便是参与者之一，其通过调控靶基因翻译过程，影响一系列蛋白表达，从而抵抗应激反应。了解miRNAs与应激之间的联系，对阐明运输应激发生发展机制有着深远意义。miR-23a的表达失调会导致多种疾病，某些miRNA基因已被分类为癌基因或抑癌基因。此外，在应激细胞中抑制miR-23a能够阐释诱导细胞凋亡的一般机制，并被分子伴侣HSP70调控。miR-23a参与多种癌症的发生发展过程。有文献报道，miR-23a在结肠癌、胃癌和肺癌等腺癌中具有高表达的特性[3,4],具有调控细胞的正常生长和分化，和多种恶性肿瘤的生长和转移等生物学行为具有密切相关性。miR-23a在应激发生中可能发挥的生物学功能，是本研究的目的所在。

1 试验方法

1.1 材料与方法

试验动物及分组试验与牛场随机选取10头体重相近的健康杂交肉牛分为对照组和运输刺激组，运输刺激组以单层动物运输汽车运输进行运输刺激，速度为80 km/h。运输过程中禁食、禁水。

1.2 高通量测序

采集肝脏组织深圳基因组学研究所的程序（BGI BGISEQ-500，中国）进行高通量测序，制备运输应激肉牛肝脏miRNA文库。

1.3 对miR-23a进行生物信息学分析

应用Targetscan、miRWalk和miRTarBase三款软件对miR-23a的靶基因进行预测分析，对miR-23a可能发挥的潜在功能进行预测，以便了解miR-23a的生物学功能。

1.4 miR-23a候选靶基因功能富集分析

利用Gene ontology(http://geneontology.org/)对miR-23a参与的生物学进程进行Geneontology分析，进行靶基因的功能研究，以牛（bos taurus）基因组作为背景基因，对miR-23a靶基因参与的生物学过程进行富集分析。从而筛选出与运输应激相关性强的靶基因。

2 结果

2.1 肝脏组织中miR-23a表达量的变化

使用高通量测序方法检测肉牛肝脏中miR-23a的相对表达量。与运输0 h组相比，运输6 h组肝脏组织中miR-23a表达量上升（见表1）。

表1 肉牛肝脏miR-23a表达量

2.2 Go富集分析结果

应用Targetscan、miRWalk和miRTarBase三款软件对miR-23a靶基因预测，Targetscan中预测到1 238种靶基因；miRWalk中预测到10 112种靶基因；miRTarBase中预测到427种靶基因。三款软件预测到的靶基因重合情况如图1和表2所示。

图1 miR-23a靶基因预测统计图

2.3 生物信息学分析结果

2.3.1 生物进程 通过GO分析(http://amigo.geneontology.org/amigo/search/anno-tation) 绘制出miR-23a靶基因参与的生物进程。如图2所示，miR-23a主要参与14种生物过程，其中富集靶基因较多的前三项过程为细胞过程，代谢过程，生物调节富集靶基因这些过程均与应激存在联系，其中对刺激的反应这一过程与应激联系密切。

图2 miR-23a参与的生物学进程图

2.3.2 分子功能 通过GO分子功能分析，miR-23a主要参与7种“分子功能”过程（见图3），包括斑点、催化活性、分子功能调节剂、结构分子活性、转录调节因子活性、转运蛋白活性。

表2 miR-23a的靶基因统计

图3 miR-23a参与的分子功能

2.3.3 细胞组分 miR-23a主要参与11种“细胞组分”过程（见图4），包括细胞组分、细胞、细胞外区部分、含蛋白复合物、超分子复合物。

图4 miR-23a参与的细胞组分图

3 讨论

在集约化养殖发展的过程中，运输成为一项常见且危害极大的应激原，运输可造成肉牛运输应激综合征等多种疾病进而影响肉牛的健康，同时也会造成巨大的经济损失。研究表明，运输会造成肉牛发生应激反应，影响免疫力，同时造成细胞因子和应激相关激素的变化，同时造成miRNSs表达失调，影响相关蛋白的表达。检测肉牛肝脏中miRNAs的表达变化，可以作为评估肉牛应激状态的新手段。本试验通过高通量测序技术筛选出肉牛运输后差异表的miR-23a，并对其进行生物信息学分析。通过对靶基因的生物信息学分析发现，miR-23a可能与HSPA13、MAP3K5、AKT3、IL6R等基因结合，从而调控其靶向蛋白的表达。研究表明，miR-23a-5p对大鼠脑缺血再灌注氧化应激反应具有抑制作用[5]，沉默miR-23a并过表达gls1，可以逆转H2O2诱导的氧化应激，对细胞氧化损伤的抑制作用[6]。miR-23a参与多种疾病的发展过程，并可以调控细胞周期[7]。研究显示，肝细胞癌组织中miR-23a-3p的表达水平明显上调，并可以促进肝细胞癌G1/S细胞周期转化[8]，HSPA13家族与应激关系密切，研究表明，HSPA13的下调会提升细胞凋亡的敏感性，促进炎症反应并维持细胞存活[9]。当运输刺激发生时,miR-23a表达量的降低，有可能会促进Akt基因的表达，Akt蛋白激酶在细胞凋亡、细胞增殖、细胞分化、生理代谢等细胞生理病理活动的调控中起着至关重要的作用，因此，miR-23a、HSPA13、Akt三者密切相关。李梦雯等人研究结果显示氧化应激可诱导细胞中HSPA13表达上调，通过KEGG分析发现，HSPA13与PI3K-Akt信号通路、TGFβ信号通路相关，这与研究相符，同时HSPA13可以保护细胞，减轻氧化损伤。当动物处在应激状态时，miR-23a表达发生改变，且调控HSPA13、Akt等蛋白表达来抵抗应激的发生，减轻或避免疾病发生，因此在畜牧疾病防控中发挥关键作用。本文通过对运输应激肉牛肝脏miR-23a进行生物功能分析，能够为肉牛应激的发生发展提供理论参考。