沉默PI3K基因对E2刺激后子宫内膜癌细胞增殖和凋亡的影响*

陈 坤，张洁清，李 力

(广西医科大学附属肿瘤医院妇瘤科，南宁 530000)

子宫内膜癌(endometrial cancer,EC)是女性生殖系统常见恶性肿瘤之一，无孕激素拮抗的雌激素长期刺激被认为是EC发病的主要原因之一，但详细分子和基因改变仍无明确论断[1]。雌激素可通过非转录效应迅速激活细胞内的PI3K/Akt激酶级联反应，进而影响内膜癌细胞的增殖与凋亡[2-3]。本课题组前期研究证实,PI3K/Akt通路对子宫内膜癌的雌激素调控机制发挥一定作用[4]。本实验通过慢病毒载体介导的siRNA使PI3K基因沉默，研究E2作用下PI3K基因低表达对子宫内膜癌Ishikawa细胞的增殖与凋亡的影响，旨在探讨PI3K基因能否成为EC分子治疗的潜在靶点。

1 材料与方法

1.1 细胞与材料 人子宫内膜癌Ishikawa细胞(雌激素受体阳性)由北京大学妇科实验室魏丽惠教授馈赠。慢病毒载体构建和包装(上海吉凯基因公司)，X-tremeGENEHP DNA转染试剂(Roche公司)；PI3K引物(上海生物工程公司)；逆转录试剂盒(美国Fermentas公司)；细胞周期试剂盒和Annexin-V-PI凋亡检测试剂盒(美国BD公司)；PI3K、VEGF、bFGF抗体(美国Cell-signaling公司)；兔抗人远红外二抗DyLight800(美国LICOR公司)。

1.2 慢病毒表达载体构建和细胞转染 依据说明书设计4组针对PI3K基因的siRNA，构建shRNA质粒载体后转染细胞。利用RT-PCR和Western blot筛选出沉默效果最佳干扰靶点，siRNA序列为：GAGACCAATACTTGATGTGGTTGACTAA，将选取的靶点包装成慢病毒shRNA载体，包装滴度为8×108TU/mL,感染Ishikawa细胞。将感染目的基因的Ishikawa细胞，经流式分选获得稳定的细胞株(预实验)。慢病毒LV-PI3K-RNAi稳定转染Ishikawa细胞，实验分为3组：PI3K组：转染LV-PI3K-RNAi慢病毒的Ishikawa细胞；NC组：转染阴性对照慢病毒的Ishikawa细胞；Control组：未转染的Ishikawa细胞。将Ishikawa细胞按1×105细胞/孔接种于6孔板，待细胞融合率约为50%时，将LV-PI3K-RNAi慢病毒和阴性对照慢病毒以MOI=50加入细胞中，加终浓度为5μg/mL的polybrene增强感染效率，8h后更换正常细胞培养液。72h后用荧光显微镜观察，评估转染效率。荧光定量PCR(qRT-PCR)检测PI3K mRNA表达：PI3K上游引物为5'-TGGAAGCAGCAACCGAAAC-3'，下游引物为5'-CATTGAGGGAGTCGTTGT-3'；Western blot检测PI3K蛋白的沉默表达效果。

1.3 qRT-PCR及Western blot检测E2刺激对PI3K基因沉默后Ishikawa细胞VEGF、bFGF mRNA及蛋白的表达 实验分4组：PI3Ki组：E2刺激前期构建的PI3K-RNAi细胞；Ishikawa组：加1×10-6mol/L E2作用Ishikawa细胞30min；NC组：E2作用转染了阴性对照慢病毒的Ishikawa细胞；对照组：仅加入无血清DMEM培养基。取各组细胞，提取总RNA，按说明书逆转录成cDNA进行PCR扩增，以GAPDH为内参。反应条件：95℃预变性10min；94℃变性10s，62℃(收集荧光)60s，40个循环。采用(2-ΔΔCt)法进行相对定量分析。实验重复3次，取均值。收集各组细胞，提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。取50μg蛋白，行SDS-PAGE电泳分离，将电泳产物转至PVDF膜，5%牛血清白蛋白(BSA)封闭1h，分别加一抗VEGF(1∶100)、bFGF(1∶1000)，4℃孵育过夜，再加入兔抗人远红外二抗DyLight800室温孵育1h，含0.05%Tween-20的枸橼酸盐缓冲液(TBST)洗膜；用红外二抗扫膜仪Odssey扫膜并分析数据。实验重复3次，取均值。

1.4 MTT检测细胞增殖 将处理后细胞按7000细胞/孔接种于96孔板，每组5个复孔，于5%CO2、37℃恒温培养箱过夜；PBS清洗细胞，更换无血清培养液培养24h后,各组加1×106mol/L的E2，对照组继续用无血清培养液培养；分别于1～7天，每天取出一块培养板，每孔加20μL 5mg/mL MTT，孵育2h。弃培养液，各孔加150μL DMSO，震荡15min，用酶标仪在490nm处测定每孔吸光度值。

1.5 流式细胞仪检测细胞凋亡 将细胞按1×106细胞/孔接种于6孔板，按说明书对各组细胞进行加药处理，用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

2 结 果

2.1 转染慢病毒表达载体后PI3K基因及蛋白的沉默效果 PI3K组的PI3K mRNA抑制率为(8.67±3.06)%,PI3K蛋白抑制率为(28.01±4.36)%。与Control组及NC组比较，PI3K基因表达明显抑制(P<0.05)。见图1。

图1 转染慢病毒表达载体后PI3K基因及蛋白的沉默效果

2.2 沉默PI3K基因后E2对各组细胞VEGF、bFGF表达的影响 PI3Ki组细胞中VEGF mRNA及蛋白表达水平与Ishikawa组、NC组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；后两组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 E2对沉默PI3K基因后的各组细胞VEGF bFGF基因及蛋白表达

2.3 MTT法检测PI3K低表达对Ishikawa细胞增殖能力的影响 与Ishikawa组及NC组比较，PI3Ki组细胞的增殖能力明显减弱(P<0.05)；前两组比较差异则无统计学意义(P>0.05)。见图2。

图2 PI3K基因沉默后E2对各组细胞后增殖的变化

2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡 PI3Ki组细胞的中晚期凋亡率高于Ishikawa组[(5.93±0.94) vs (2.92±0.51)],总凋亡率(%)高于Ishikawa组[(10.75±0.54)vs(6.80±0.35)]，差异均有统计学意义(P均<0.05)。Ishikawa组的总凋亡率(%)与NC组比较，差异有统计学意义[(6.80±0.35)vs(7.15±0.25)，P>0.05]。见图3。

图3 PI3K基因沉默后E2对Ishikawa细胞凋亡的影响

3 讨 论

妇科肿瘤的发生发展过程常常伴随着基因突变和信号通路的异常激活与持续活化，PI3K(磷脂酰肌醇三激酶)作为PI3K/Akt/mTOR通路的重要细胞信号分子，参与了一系列女性癌症的发生，如乳腺癌、卵巢癌和子宫内膜癌等。PI3K与细胞表面的各类受体相互作用导致自身构象改变而激活，被激活的PI3K将底物4，5-二磷酸脂酰肌醇[PI(4，5)P2]磷酸化成3，4，5-三磷酸酯酰肌醇[PI(3，4，5)P3]，使其作为细胞内的第二信使与Akt的PH结构域结合并促使其构象发生改变，暴露PI3K下游蛋白Akt的结合位点：Ser473和Thr308，进而启动一连串下游靶基因促进细胞的增殖迁徙和血管生成[5]。研究发现，E2能以依赖于ER的方式和不依赖于ER的方式在Ishikawa中迅速激活PI3K/Akt信号通路[6]，表明探索子宫内膜癌致病相关信号通路时不能忽略雌激素的潜在效应。结合Gu等的裸鼠移植瘤实验[7]，发现抑制PI3K/Akt通路可恢复癌细胞中的PR表达并激活经典PR途径，逆转子宫内膜癌中的孕激素抵抗。因此，抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路上相关分子和检测雌孕激素与该通路的相互作用已成为子宫内膜癌抑癌治疗方案。

实体瘤释放分子信号到周围正常组织，激活相关基因生成蛋白来促进血管新生以维持肿瘤内部血供和营养输送，晚期肿瘤的扩散和转移也与之息息相关。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一种内皮细胞特有促分裂原[8]，防止内皮细胞凋亡，促进其生长和增殖，调节血管通透性正向调节肿瘤血管生成，而bFGF可通过促进VEGF表达直接诱导肿瘤血管形成。本课题组前期研究发现[4]，E2能激活子宫内膜癌细胞Akt通路，产生VEGF、bFGF，促进血管生成因子的表达，促进肿瘤增殖侵袭转移。PI3K/Akt信号传导通路是抗凋亡、促增殖的信号转导途径，活化的Akt可增加NF-κB的转录活性，调节抗凋亡基因的转录，增加肿瘤细胞的运动功能，有助于癌细胞侵袭[9]。本研究结果显示，PI3K低表达可干扰E2促进子宫内膜癌细胞增殖和抑制子宫内膜癌细胞凋亡。

综上所述，抑制PI3K表达可降低E2作用子宫内膜癌细胞增殖及抑制凋亡的影响，为子宫内膜癌治疗提供新的思路。