超声-溶剂萃取去除银杏叶提取物中的银杏酸

刘茜倩，刘伶文，王晓军， 武翰文

(西安工程大学 环境与化学工程学院，陕西 西安 710048)

0 引 言

银杏叶提取物(Ginkgo biloba extract，GBE)是以银杏科植物银杏(Ginkgo biloba L.)的干燥叶经加工制成的一类产品。其品质主要取决于银杏黄酮和银杏萜内酯的含量[1-4]。银杏叶中除有效成分黄酮类、萜内酯类外，还含有微量的，具有致敏性、致突变、细胞毒性等作用的银杏酸[5-7]。可抑制大脑内谷氨酸转变成γ-氨基丁酸，进而使大脑细胞功能丧失[5]。近年来，银杏酸的药理作用，尤其是在抗肿瘤、抑菌杀菌、抗病毒、杀虫和抗氧化活性等方面研究逐步深入[8-10]。

目前，分离银杏酸的常用手段是化学提纯。除此之外，热回流法、碱提酸沉法、柱层析分离、超临界CO2萃取、大孔吸附树脂富集等也是经常采取的方法。热回流法溶剂多采用乙醇。该法虽简单，但提取率低且不利于与银杏黄酮等成分分离，对银杏叶提取物药理作用影响较大[11]。马慧等采用碱提酸沉法提取银杏酸。经优选的提取工艺操作简单、稳定易行, 但产品纯度不高、酸消耗量大，需要脱盐纯化。同时，酸碱作用易影响银杏叶提取物中其他活性成分，不适用于银杏叶提取物中银杏酸的去除[12]。超临界CO2萃取法具有操作方法简便、有机溶剂使用量少、得率高、纯度高、环境污染小等优点，但该工艺成本较高，不利于大量生产[13]。唐仕荣等采用大孔径树脂和高速逆流色谱联合分离，制备高纯度银杏酸单体组分，可有效分离纯化银杏酸组分，但该方法主要用于银杏酸单体组分的开发利用[14]。

和上述萃取技术相比，超声波萃取速度快、价格低、效率高，不需求高温，具有广谱性[15-16]。超声波萃取是利用超声波具有的机械效应、空化效应和热效应等一系列物理、化学效应，通过增大生物细胞的破碎程度、介质分子的运动速度、穿透力以萃取生物有效成分[17-18]。为降低银杏叶提取物中由银杏酸带来的毒副作用，本文用超声辅助溶剂萃取去除银杏酸。对银杏叶提取物中银杏酸的去除工艺进行优化，建立一种低投入、耗时短、易放大并降低GBE毒副作用的工艺，为工业化生产提供借鉴。

1 实 验

1.1 材料与仪器

银杏叶粉末(市购，去毒、洗净、磨粉后过筛备用)；单体银杏酸(上海源叶生物科技有限公司)；正己烷、石油醚、乙酸乙酯、冰醋酸、甲醇、乙醚、环己烷等试剂均为分析纯。

Biosafer650-92型超声波细胞粉碎仪(赛飞(中国)有限公司)；ZF-6型三用紫外仪(北京市六一仪器厂)；754PC型分光光度计(上海菁华科学仪器有限公司)；R-205型旋转蒸发仪(上海申顺生物科技有限公司)。

1.2 银杏酸的提取及检测

以银杏叶粉末为原料，用70%乙醇为提取液。按照料液比1∶8，常温下浸提15 min;在功率190 W下，超声提取40 min;再经抽滤、离心，得到银杏叶粗提液。将银杏叶粗提液置于旋转蒸发仪中进行旋蒸，得到浓缩膏。

取银杏叶浓缩膏，稀释后加一定的萃取溶剂，按照一定的液料比、超声功率、超声时间和超声间隔时间进行萃取；在分液漏斗中静置分层，用UV法分别测定萃取后上相和下相中银杏酸的含量，计算银杏酸的去除量Q。

(1)

式中：Q为银杏酸的去除量，mg/g；V1为层析样品的体积，mL；C1为样品中银杏酸的质量浓度，g/mL；V为浓缩膏总体积，mL。

1.3 标准曲线的绘制

准确称取20 mg银杏酸标准品于25 mL量瓶中，用甲醇定容，得质量浓度为0.8 mg/mL的银杏酸标准溶液。取0.08 mg/mL的银杏酸标准溶液于200～800 nm之间进行光谱扫描。因在310 nm处有最大吸收峰，故选择测定波长为310 nm。

用甲醇分别配置质量浓度为0.04、0.08、0.12、0.16、0.20 mg/mL的标准溶液，测定310 nm处的吸光度。以银杏酸质量浓度C为横坐标，吸光度A为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程为

Y=4.684 3x-0.003 8，R2=0.999 1

1.4 样品中银杏酸的检测

准确量取分液所得上、下相各5 mL，分别定容至10 mL，用微量注射器取0.2 mL在已制备好的薄层硅胶板上进行条状点样，以V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)∶V(冰醋酸)=18∶1∶1作为展开剂展开后，置于三用紫外仪下，在254 nm波长处观察，银杏酸发出蓝色荧光。选取显蓝色荧光的部分进行甲醇洗脱，洗脱液分别定容至10 mL，然后进行UV检测。

以甲醇为参比，取样品于310 nm处测定吸光度值，通过线性回归方程计算银杏酸的浓度，从而算出银杏酸的去除量。

1.5 超声辅助溶剂萃取去除银杏酸的工艺条件

综合考虑银杏酸去除过程中溶剂的极性和毒性、挥发性和经济性，最终选用正己烷作为萃取剂。通过单因素实验，分别考察料液比、超声功率、超声时间、间隔时间、超声次数对银杏叶提取物中银杏酸去除量的影响。

1.6 响应面优化确定最佳萃取工艺

综合各单因素实验结果，选取对银杏酸去除量影响最大的3个因素，分别在其最优值周围选取3个水平，采用Design-expert软件进行响应面实验设计，建立数学模型优化超声波辅助溶剂萃取银杏酸的工艺。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果

2.1.1 料液比 料液比对银杏酸萃取去除效果的影响如图1所示。

图 1 料液比对银杏酸去除量的影响Fig.1 Effect of material-liquid ratio on the amount of ginkgolic acid

在所选料液比的区域内，银杏酸的去除量呈现先上升后下降的趋势；在1∶20时达到最大，去除量为3.18 mg/g。一方面当溶剂量较小时，萃取易达到饱和，去除量较低；当溶剂量增多时，萃取量增加，去除量也增高。另一方面，萃取过程遵循相似相溶原则[19]，随着正己烷投量的增加，极性不断降低。当料液比为1∶20时正已烷极性与银杏酸相当，萃取量达到最大。由此，选定料液比为1∶20。

2.1.2 超声功率 超声功率对银杏酸萃取去除效果的影响如图2所示。随着超声功率的增加，银杏酸的去除量整体呈现先上升后下降的趋势。在超声功率为320 W时达到最大，为3.41 mg/g。超声波功率越大，空化作用和机械作用越强烈，介质分子的运动速度及穿透力越大[17]，总银杏酸溶出越多。但当超声波功率超过320 W后，由于热效应增大，溶剂升温较快且易挥发，导致液料比减少，萃取不充分。同时，功率过大破坏了银杏酸结构，去除量降低。由此，选定超声功率为320 W。

图 2 超声功率对银杏酸去除量的影响Fig.2 Effect of ultrasonic power on the removal amount of ginkgolic acid

2.1.3 超声时间 超声时间对银杏酸的萃取去除效果的影响如图3所示。

图 3 超声时间对银杏酸去除量的影响Fig.3 Effect of ultrasonic time on the removalamount of ginkgolic acid

超声时间在10～15 min时，银杏酸的去除量上升，并在15 min时达到最高的2.73 mg/g;15 min后，银杏酸的去除量下降。这是因为超声波的机械效应及空化效应能够促使介质分子的穿透力增大，进而使胞内银杏酸释放。但超声波持续工作可能会破坏银杏酸的结构，同时有可能破坏银杏叶提取物中其他组分结构。由此，选定超声时间为15 min。

2.1.4 超声间隔时间 超声作用时间间隔对银杏酸萃取去除效果的影响如图4所示。

图 4 超声间隔时间对银杏酸去除量的影响Fig.4 Effect of ultrasonic time interval on the removal amount of ginkgolic acid

随着超声间隔时间的增加，银杏酸的去除量逐渐上升，在0.5 s时达到最大，为3.19 mg/g。之后，银杏酸去除量呈下降趋势。原因是改变超声间隔时间，相当于改变了超声作用的频率，间隔时间越长，频率越低。频率的改变直接影响机械效应、空化效应和热效应等一系列物理、化学效应。较低频率超声有利于可溶物的释放，和溶剂的渗透，提高活性成分的转移[20]。但当超声间隔时间较长时，震动频率较低，又不利于银杏酸的溶出。由此，选定超声间隔时间为0.5 s。

2.1.5 超声次数 超声次数对银杏酸萃取去除效果的影响如图5所示。

图 5 超声次数对银杏酸去除量的影响Fig.5 Effect of ultrasonic frequency on the amount of ginkgolic acid

随着超声次数的增加，银杏酸去除量呈现先上升后降低的趋势，在提取次数为2次时，银杏酸的去除量最大，为3.37 mg/g。这是由于超声次数的增加可以提高萃取效率，但多次的超声产生的热效应也可能对提取物的结构造成破坏，超声次数对银杏酸结构的影响还有待深入研究。由此，选定超声次数为2次。

2.2 响应面优化结果

2.2.1 响应面回归模型 分别选取液料比(A)、超声时间(B)和超声功率(C)为自变量，以银杏酸去除量(Y)为响应值，进行3因素3水平的中心组合实验。响应曲面实验结果见表1。用Design-Expert 8.0.6软件对表1实验结果进行二次回归响应面分析，建立二次多元回归模型：

Y=3.40-0.025A-0.026B+0.006C+0.005AB+

0.012BC-0.078A2-0.066B2-0.14C2

表 1 响应面实验结果

2.2.2 响应面回归模型方差分析 回归模型的方差分析结果见表2 。

表 2 响应面回归模型方差分析Tab.2 The results of analysis of variance for response surface regression model

2.2.3 最优条件确定及模型验证 料液比、超声时间和超声功率对银杏酸去除量的影响如图6所示。由图6中等高线的形状可以看出：3个因素的效应大小依次为超声时间(B)、料液比(A)、超声功率(C)；这3种交互项的效应大小依次为：超声时间和超声功率(BC)、料液比和超声时间(AB)、料液比的超声功率(AC)。通过Design-Expert 8.0.6软件分析确定最优操作条件，得出回归模型存在最大值点，料液比、超声时间和超声功率对应的最佳值分别为1∶19.17、13.97 min和320 W。在此条件下，银杏酸去除量为3.468 mg/g。为了验证模型方程的适用性，以及在实际应用中的可行性，提取条件调整为料液比1∶19、超声14 min、超声功率320 W。在此条件下重复验证3次，得到的银杏酸去除量为3.463 mg/g，与预测值吻合度好，说明响应面设计优化银杏酸萃取去除最佳条件准确可靠。

(a) 料液比、超声时间对去除量的影响

(b) 料液比、超声功率对去除量的影响

(c) 超声时间与超声功率对去除量的影响图 6 银杏酸去除量影响因素的响应面图Fig.6 Response surface diagram of factors affecting ginkgolic acid removal

3 结 语

本文研究了超声波辅助溶剂萃取法去除银杏叶提取物中银杏酸的工艺条件。采用单因素和响应面法优化银杏酸去除的工艺中的超声时间、超声功率、料液比、超声间隔时间、超声次数等因素。以正己烷为溶剂，确定了最佳工艺条件：超声提取14 min、超声功率320 W、料液比1∶19，超声间隙时间为每5 s间隔0.5 s，超声处理2次。在上述条件下，银杏酸的去除量为3.463 mg/g，与预测值3.468 mg/g吻合度好，表明响应面模型具有可预测性。此外，由各个因素的方差分析可知：影响因素的大小依次为超声时间、料液比、超声功率。超声波辅助溶剂萃取银杏叶提取物中的银杏酸的工艺稳定可行、溶剂用量少、耗时短。该方法可作为银杏叶提取物中银杏酸的控制手段，有效降低银杏叶提取物的毒副作用，可为工业化生产提供技术指导。