模式生物果蝇在水环境污染物毒理学中的应用及研究进展

吴进兰，卢晨瑛，吴明江，佟海滨

（温州大学生命与环境科学学院，浙江温州 325000）

0 引言

近年来，由于一些工矿企业排污设施的不健全、生态环境的破坏等原因，致使中国江、河、湖泊，甚至大海等水体污染日益加深，水中有毒、有害物质不断增多，如：挥发性有机化合物、氟喹诺酮类药物、重金属、农药和微生物毒素等。这些污染物可被植物吸收，并通过植食性昆虫和它们的捕食者在食物链中积累和传递，从而对生态系统和人类健康造成严重的威胁。目前对污染物毒性监测主要采用化学分析方法，虽然简单直接，但不能反映污染物对生物体和生态环境的潜在毒害和综合效应。研究表明，模式生物果蝇可用来检测污染物的生态毒理效应，是一种适合于遗传毒性评估的模式生物[1]。

黑腹果蝇属于双翅目昆虫，体长约0.3 cm，广泛分布于除南北极外的温带及热带气候区，目前至少有1000个以上的果蝇物种被发现[2]。果蝇具有易于饲养、生命周期短、繁殖能力强、染色体简单、突变表型多且易于观察等诸多优点，是科研领域最为经典、最为重要的模式生物之一[3]。此外，果蝇中的基因与人类高度同源，以果蝇为模型进行人类疾病等相关研究不仅成本低，而且不受伦理上的限制[4]。果蝇的研究已有100多年历史[5]，早在1910年，美国遗传学家Morgan用果蝇作为遗传研究对象，获得了果蝇的第一个突变体——白眼果蝇[6]。在此基础上，Morgan提出了一个革命性的染色体遗传理论，奠定了经典遗传学的基础，开创了利用果蝇作为模式生物研究的先河。

本研究通过总结黑腹果蝇应用于水环境挥发性有机化合物、喹诺酮类药物、重金属、农药和微生物毒素等常见污染物的研究，突出水环境污染物对水生动物和人类的危害，以及果蝇用于毒理学研究的优势，为今后利用果蝇研究污染物毒理效应以及抗毒机制提供参考。

1 有机污染物对果蝇毒性效应研究

苯、甲苯和二甲苯是环境中最常见的挥发性有机化合物(Volatile organic compounds,VOCs)，流行病学数据显示，短期接触VOCs可导致眼睛和呼吸道刺激、头痛、头晕、视觉障碍和记忆力受损，而长期吸入VOCs则可能损害肝脏、肾脏和中枢神经系统等[7]。在动物和细胞的研究中发现，暴露于VOCs环境下会诱导活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的过量产生，如超氧阴离子、羟基自由基、过氧化氢等，从而导致氧化应激的发生。在雄性小鼠模型中，VOCs可引起小鼠大脑ROS的大量产生，导致行为和学习能力降低[8-9]；在大鼠肾小管细胞中[10]，过量的ROS产生，会导致多种过激的应激反应发生，损伤不同的细胞成分，如蛋白质、基因组和线粒体DNA，以及一些膜系统。此外，一些遗传毒性应激源不仅破坏遗传稳定性，而且直接或间接影响基因表达[11]。Doganlar等[12]研究发现，VOCs可导致黑腹果蝇发生氧化应激，DNA突变，蛋白质破坏，以及一些与热休克蛋白(Heat shock proteins,HSPs)和抗氧化系统有关蛋白如锰超氧化物歧化酶(Mn-superoxide dismutase,Mn-SOD)、过 氧 化 氢 酶(Catalase,CAT)和谷胱甘肽合成酶(Glutathione synthetase,GS)的转录和表达失调。并且Mahendra等[13]认为Hsp70、Hsp60、Hsp83和Hsp26这些应激基因的表达可以作为检测早期细胞毒性的一种方法。此外，Mahendra还用果蝇模型测试了这些化合物的遗传毒性和促凋亡潜能[14]，他们发现三龄幼虫分别暴露于1～100 mM苯、甲苯或二甲苯中12 h、24 h和48 h，果蝇以浓度和时间依赖的方式显著增加了凋亡标记物的表达和遗传毒性。果蝇生长繁殖速度快，能够在较短时间内在多个后代水平上，检测污染物对其生长、繁殖、代谢等生理生化特性的影响。而对哺乳动物小鼠模型而言，获取这些数据则需数月甚至数年以上的时间，且在实验设备、采样工具及操作步骤等方面比果蝇更加复杂、昂贵。因此，果蝇可作为研究苯、甲苯和二甲苯等挥发性有机化合物毒理学的合适模型，为阐明VOCs污染物的毒性机制以及遗传毒性做深入研究。

三氯乙烯(Trichloroethylene,TCE)是地下水中的一种氯化有机污染物，饮用水受TCE污染可能对动物和人类造成严重的器官损害[15]。TCE在体内的代谢主要是通过两个不可逆的途径。第一个途径是细胞色素P450介导的氧化，主要产生三氯乙酸和二氯乙酸等生物活性代谢物；第二个途径是与谷胱甘肽结合，在谷胱甘肽S-转移酶(Glutathione S-transferase,GST)的催化下，形成S-1,2二氯乙烯基谷胱甘肽，并进一步代谢为生物活性突变代谢物S-1,2二氯乙烯基-L-半胱氨酸[16]。Abolaji等[17]选择TCE对果蝇氧化应激和抗氧化标记物进行评价，结果表明，TCE能显著提高果蝇ROS水平，抑制CAT、GST以及乙酰胆碱酯酶(Acetylcholin esterase,ACHE)活性，同时降低总巯基水平。当今，大多数氯代烃都被国际癌症研究中心判定为致癌、致畸、致突变的“三致”物质，而果蝇具有染色体简单、突变表型多和易于观察，且无伦理学争议等优点，使得果蝇在研究TCE“三致”的毒理学机制中发挥着重要的角色。

2 氟喹诺酮类药物对果蝇的毒性效应研究

氟喹诺酮类药物，如吉米沙星(Gemifloxacin,GE)和环丙沙星(Ciprofloxacin,CIP)，是广泛使用的一类抗生素，用于人类，牲畜、家禽和鱼类养殖，最终可通过多种途径排放到环境中，包括制药工业的残余水、医院废物、污水处理厂以及养殖场的废水和粪便废物的土地都检测到它的存在。研究调查发现，国内水生环境中已经大量检测到氟喹诺酮类抗生素[18]，其中，CIP是废水处理厂废水含量最高的药物，并且已经证明CIP可导致鱼类在早期生命阶段出现形态异常[17]。2019年美国食品和药物管理局报道氟喹诺酮会严重损害人体细胞，可能导致多个器官出现严重损伤[20]。Aslan等[21]探讨了GE对黑腹果蝇存活率、发育及成虫寿命的影响。结果发现，GE对果蝇幼虫、蛹和成虫的发育都有不良影响。较低浓度的GE能延长黑腹果蝇雌雄成虫的寿命，但在最高浓度的GE可降低其寿命。Liu等[22]通过测定CIP对果蝇的不同用药时间(48 h、72 h、96 h)的LC50值，证明了CIP可导致果蝇个体寿命缩短，发育迟缓，较多幼虫未能化蛹或孵化。Bidell等[23]指出需要进行更多的研究，以阐明氟喹诺酮类药物的毒性作用。而果蝇具备成熟的研究技术，完整的基因组测序，最重要的是，在基因结构和功能上与包括人类在内的高等动物极为相似，可更好地阐明氟喹诺酮类抗生素在生态和人类健康方面所造成的潜在危害提供科学依据。

3 重金属对果蝇的毒性效应研究

重金属镉是环境中一种特别常见和严重的污染物，普遍存在于土壤、空气和水中。镉因具有剧毒效应和未知的生理作用而特别受关注[24]。镉处理果蝇细胞株诱导热休克蛋白合成增加，可能与镉毒性导致DNA损伤和蛋白质合成干扰有关[25]。果蝇细胞经镉暴露后，可以取代金属酶中的锌，并与其他蛋白质的自由巯基相互作用，导致蛋白质合成减少以及细胞死亡。Giaginis等[26]讨论镉对DNA修复过程的抑制作用，包括核苷酸切除修复、碱基切除修复和错配修复，镉可以替代DNA修复着色性干皮症A组蛋白(Xeroderma pigmentosum group A,XPA)中锌指结构中的锌，从而导致变形和失活[27]。Hu等[28]检测了镉对果蝇的生殖力、GST和ACHE的活性以及防御相关基因(Hsp70、Gstd2和Gstd6)的表达。研究发现镉显著延长了雌性的交配潜伏期，并减少了产卵量，但对雄性生殖力没有影响[29]。镉通过直接和间接的毒性作用对果蝇的生长发育的损伤，导致果蝇的化蛹时间和羽化时间延长，蛹化率和羽化率显著降低，表明果蝇有潜力成为镉污染监测的指示生物。

铅也是一种常见的有毒污染物，可对人体的健康产生不利影响。铅进入人体会损伤细胞器和重要的蛋白质[30-31]，包括新陈代谢所需的酶，最终导致人体认知受损、免疫力下降和心血管系统缺陷。Nanda等[32]以果蝇为模型发现进食铅后的果蝇出现蛹化率降低且蛹化时间延长，死亡率增加，这可能是因为铅诱导果蝇全身DNA损伤。在铅环境中生长的果蝇幼虫体长较小且有小黑斑，表明摄入铅后的果蝇血细胞数量减少和酚氧化酶(Phenol oxidase,PO)活性降低。在果蝇、斑马鱼和小鼠等模型生物的研究中，已经阐明了铅暴露导致细胞蛋白合成过程中断的机制，但铅的毒性影响也可能是跨代的，因此果蝇在科学评估铅毒性及其长期危害中具有其独特的优势。

甲基汞(MeHg)是由水生沉积物中的厌氧微生物介导汞甲基化而产生的，它可以在水生食物链中积累，是一种高毒性环境污染物，对中枢神经系统危害极大[33]。Leão等[34]研究发现，暴露于甲基汞中会导致果蝇的存活率、发育率以及运动能力下降。甲基汞与硒醇基团结合紧密，可用作甲基汞解毒剂[35]，然而研究人员发现硒化合物二苯二硒并不能阻止甲基汞对黑腹果蝇的毒性作用，反而导致其对果蝇的毒性增强。近年来利用果蝇作为研究影响人类神经系统疾病的分子机制已经有了很多的报道[36-37]。果蝇保留了与人类共同的代谢通路，并且有越来越多的证据表明果蝇昼夜节律[38]调节机制和学习记忆[39]过程与人类相似。因此，果蝇和哺乳动物暴露于甲基汞可能会导致类似的生理变化，这提示果蝇也可作为研究甲基汞神经毒性的良好模型。

氯化汞(HgCl2)是一种广泛应用于农业和医药的重金属化合物，是一种危害动物胃肠、肾脏、肝脏和神经元等组织的环境污染物[40]。其毒性主要归因于汞结合并抑制某些抗氧化因子的能力，从而导致有害活性氧的过量产生。果蝇中肠的结构组织和功能与哺乳动物具有相似性，可以作为研究汞中毒对消化系统的影响[41]。Chen等[42]发现HgCl2主要积累在果蝇中肠内，摄入HgCl2的果蝇中肠内ROS局部过量产生，凋亡的上皮细胞增多。与中肠相比，对汞毒性易感的大脑没有观察到明显的细胞死亡和活性氧生成，这可能是因为大脑受到其它类型的损伤并没有被检测出来。利用果蝇探讨汞污染对动物以及人类的肠道和神经的影响，将为系统研究汞对动物和人类的遗传毒理及生物学效应提供依据。

铜是所有生物体必需的微量元素，是多种酶结构和催化功能所必需的重要辅助因子。但农药、杀菌剂以及工业废物的过度生产使用，使得二价铜(Cu2+)成为严重的环境污染物[43]。在大脑中，Cu2+的毒性可导致海马和额叶皮层的氧化应激、谷氨酸兴奋性毒性、凋亡和星形细胞增多，以及学习和记忆受损[44]。饮用水中的低浓度Cu2+可能会导致哺乳动物的神经毒性，影响认知，并与许多神经退行性疾病的发病机制有关[45]。在生理水平上，果蝇幼虫期暴露在Cu2+环境中会降低存活率并延缓发育，同时降低成虫体重、生殖力和存活率[46]。Klimaczewski等[47]发现，Cu2+喂养的果蝇在负向趋地性能方面有损害，死亡率升高，并且ACHE和GST活性显著降低，抗氧化酶如Sod、Cat、硫氧还蛋白还原酶(Thioredoxin reductase,Trxr1)和核因子E2相关因子2(Nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2)的mRNA水平显著升高。由此可知，Cu2+对果蝇的生长发育都存在一定的毒副作用。另外，Zamberlan等[48]研究了Cu2+对雌雄成虫发育和学习记忆的影响，发现暴露于Cu2+中，幼虫、蛹和成虫的死亡率增加，成虫的记忆力下降，并且雄性果蝇比雌性果蝇更容易受到Cu2+毒性的影响。近年来，重金属等环境化学物质污染在世界范围内引起了广泛关注，而铜做为人体必需的微量元素，其污染带来的潜在危害往往会被忽视。重金属Cu2+进入河流、土壤，不能被生物降解从而累积在动植物体内，最终通过食物链进入人体。因此研究重金属Cu2+潜在的危害以及深入的毒性机制至关重要。果蝇具有独特的生理优势，在研究重金属Cu2+对人类潜在的危害中将发挥重要的作用。

4 农药对果蝇的毒性效应研究

阿特拉津(Atrazine,ART)是一种用途广泛的除草剂，也是一种常见的环境污染物。动物接触ART可能会影响发育、繁殖和能量代谢[49]。在一些体内和体外模型中，ART可诱导氧化损伤、细胞毒性和凋亡，最后导致神经、肝和肾损伤[50]。有研究发现，ART与多种代谢途径密切相关，ART暴露(5 mg/kg)可显著改变小鼠血浆代谢物的分布[51]，而ATR（250 mg/kg和500 mg/kg）暴露14天具有免疫系统毒性，表现为脾脏细胞数量、脾脏重量和胸腺重量显著下降[52]。Fernanda等[53]研究了ART对黑腹果蝇胚胎和幼虫发育过程中存活率和氧化还原代谢的影响，发现ART降低了果蝇的蛹化率和羽化率，但没有改变果蝇的发育时间和性别比，他们还发现ART可导致果蝇活性氧生成增加、抗氧化能力减弱，从而造成氧化损伤。此外，ART还降低了果蝇抗氧化基因（Keap1、Sod、Sod2、Cat、Irc、Gss、Gclm、Gclc、Trxt、Trxr-1和Trxr-2）的转录水平。以上研究表明，ART能够诱导黑腹果蝇在胚胎和幼虫发育过程中抗氧化防御相关的基因表达谱的改变，导致氧化应激损伤。此外，Figueira等[54]对果蝇胚胎和幼虫发育期间的行为和多巴胺能神经传递进行了评估。当分别给予10 μM和100 μM ART暴露时，雌蝇表现出静止时间的增加和探索活动的减少。多巴脱羧酶和多巴胺受体的基因表达也仅在ART暴露的雌蝇中增加，但对雄蝇均无显著影响。他们认为阿特拉津对雌性果蝇的行为效应是由于多巴胺系统的紊乱造成的。ART暴露是生殖、代谢和神经系统疾病的潜在风险因素，但其毒性机理尚未深入阐明。

除草剂-二嗪农中有四种最常见的活性成分，即阿特拉津、二溴季铵、氟氮磷对丁基和麦草畏。二嗪农是一种广泛用于传统农业的有机磷杀虫剂，已在地下水、农业井、饮用水井和监测井中检测到。美国环境保护署的一项研究发现了儿童尿液中存在二嗪农代谢物。除了主要的神经毒性，二嗪农与氧化应激和血管毒性等密切相关[55]。为了深入了解二嗪农氧化应激损伤以及行为缺陷，Chaudhuri等[56]利用果蝇模型诱导其氧化应激，发现与未暴露的果蝇相比，二嗪农降低了果蝇成虫的负向趋地性反应、跳跃行为和运动节律。这项研究结果表明，二嗪农中的成分是通过竞争性结合到保护酶的活性部位，诱导氧化损伤，从而导致果蝇运动行为缺陷的发生。除草剂种类以及浓度的不同，效果也不同。Aguiar等[57]对草甘膦或基于草甘膦的除草剂对果蝇氧化应激、抗氧化防御系统以及ACHE活性研究发现，草甘膦会导致果蝇体内早期抗氧化防御系统的激活，防止ROS对机体的损害。噻虫嗪(Thiamethoxam,THIA)是一种用途广泛的农药，但其对昆虫生长发育的影响尚不清楚。Li等[58]发现THIA在致死剂量范围内可延长果蝇生长发育所需时间，降低果蝇的繁殖力、化蛹率、羽化率和寿命。此外，THIA还引发果蝇DNA损伤，降低脂肪体细胞和血细胞的活性。这些研究结果都为进一步研究水中残留农药的危害提供了依据。农药带来的水体污染已经危害到动物以及人类的健康，迫切需要研究阿特拉津、二嗪农和噻虫嗪等常见的污染物的潜在毒性及其机理。果蝇是评价农药生物毒性的一种优秀的生物模型，已被用作毒理学试验的有效工具。

5 微生物毒素对果蝇的毒性效应研究

副溶血性弧菌是一种发现于受污染海产品中的肠道病原体，通常是在食用受污染的海鲜之后，出现胃肠炎症状，包括呕吐、腹部痉挛和腹泻[59]。在致病过程中，副溶血性弧菌分泌的效应蛋白抑制宿主的先天免疫信号通路，从而使细菌逃避先天免疫系统的识别[60]。副溶血性弧菌分泌的一种效应蛋白(Vibrio parahaemolyticus,VopA)，通过丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPKs)催化结构域中关键残基的乙酰化，对MAPKs信号通路具有抑制作用。果蝇中肠和哺乳动物肠道的生理相似性和发育相似性决定了果蝇是研究人类肠道疾病的理想模式生物[61]。利用果蝇模型，Luo等[62]发现VopA的抑制活性在果蝇中仍然存在，VopA对粘着斑复合物(Focal adhesion complex,FAC)有很强的调节作用，并能显著降低粘着斑激酶(Focal adhesion kinase,FAK)Ser910位点磷酸化水平，而FAK的Tyr397和Tyr861两个酪氨酸位点磷酸化水平显著升高。此外，VopA可以破坏果蝇中肠上皮细胞的排列，扰乱肠道稳态，以促进副溶血性弧菌在宿主体内感染的机会。了解肠道上皮细胞与致病微生物之间紧密的物理、遗传和生化的相互作用，一直是肠道种群科研人员的研究目标。果蝇中肠的结构以及遗传学的保守性，有利于进一步阐明人类肠道微生物群和疾病发生发展之间的相互作用。

6 展望

随着经济社会的不断发展，空气污染、生态破坏与水体污染情况愈发严重。水体富营养化、海洋污染等问题频发，水生动植物以及人类的健康受到了严重的威胁。水体中的重金属、有机物、农药等会扰乱生物体的氧化机制和神经系统，造成严重的损伤，如改变GST和ACHE两种酶的活性以及防御相关基因的表达，生殖能力、行为能力、生存能力和学习能力降低等。而目前对污染物毒性监测主要采用化学分析方法，比如重金属可采用试剂比色法、原子荧光法和X射线荧光光谱法等分析方法；根据不同的农药类型选择气相色谱法、液相色谱法以及GC-MS-MS等通用型检测技术，但这些化学方法并不能评估污染物对动植物以及人类的危害。作为一种经典的模式生物，有关果蝇的生物学知识和实验工具已大大超过了其他的模式生物，利用果蝇模型可快速检测及筛选水环境污染物中的毒性化合物。并且，人类与果蝇的遗传背景高度保守，也使得果蝇成为研究人类疾病的最佳模型之一。与其他模型生物相比，果蝇具有寿命短、成本低、遗传物质简单的特点，利于人们观察污染物对果蝇表型的影响并探讨其机理；其生长周期短和饲养成本低则有利于人们进行大批量的毒性研究，也有利于进一步深入开展抗毒药物的研发。此外，果蝇大量的基因工具可用于探讨污染物的遗传毒性和机制研究。当然，以果蝇为模型进行毒理研究有一定的局限性，由于果蝇是低等昆虫，与人类相比，在很多方面依旧有很大的区别，但如果能很好的利用其自身优势，笔者认为利用好模式生物果蝇可能会为水体污染物对人类潜在毒理危害的相关研究提供新的思路。