自噬在再生障碍性贫血中的作用及机制研究进展

吴俏兰，陈维达，崔 兴，徐 飞，陈泽涛

（1.山东中医药大学，山东济南， 250014；2.山东中医药大学附属医院，山东济南， 250014）

再生障碍性贫血（aplastic anemia，AA），简称为“再障”，是一类难治性恶性血液病，主要特点为骨髓造血能力明显降低，干细胞、外周血中血细胞数量显著缩减，临床常以贫血、感染、出血等为表现。再障发病由多种病理生理机制联合作用，原发性获得性AA 中骨髓衰竭发病机制主要由T 淋巴细胞的异常活化、功能亢进导致的这一观点是当前大多数学者共同认可的［1，2］。近年有学者提出，自噬（autophagy）对再障的发病具有关键作用，自噬异常可能会干涉造血干细胞的分化、增殖及其性能，影响造血微环境稳态、导致免疫反应的失衡，致使再障的发生和进展［3-6］。

1 自噬

自噬作用普遍存在真核细胞内，由Porter、Ashford 最先在1962 年提出，在外界压力、缺氧、饥饿等情况下，生理性的自噬可维持细胞自身调节的平衡，而病理性自噬则会导致细胞自我调节失衡，引起代谢应激、细胞成分降解、细胞死亡等［7，8］。自噬的发生涉及30 多个自噬相关基因（autophagy-related gene，Atg）及其蛋白质复合物，过程较为复杂［9］，在营养物质或生长因子缺失的情况下，ULK 通路的激活，多种自噬相关基因及蛋白参与自噬泡、自噬体形成，如蛋白Atg5 和Atg7 形成两个泛素样偶联系统，催化LC3-Ⅱ的形成，并引导其结合到自噬体膜中，自噬体最终与溶酶体融合，实现细胞成分降解以及营养物质的循环。自噬的受损可影响到多种疾病，如衰老、神经退行性疾病、心血管疾病、免疫相关疾病等［10，11］。

2 自噬作用在再生障碍性贫血发病中的作用机制

2.1 再生障碍性贫血与自噬功能缺陷

再障患者中存有自噬功能缺陷。Atg5 突变是再障发生的原因之一，再障中的造血干细胞/祖细胞（HSPC）自噬水平显著降低，而随着再障的改善，其HSPC 自噬水平也相应提高［12］。Huang 等［13］研究发现，再障患者的CD34+细胞存有自噬缺陷，CD34+细胞的存活须要自噬，其自噬水平明显降低，分化和增殖减少、对死亡和凋亡敏感，而改善再障病情，CD34+细胞的自噬功能有所恢复。自噬是人类造血干细胞及其后代的重要调节机制，自噬可以减轻细胞应激，促进生存，自噬蛋白Atg5 和Atg7对维持人CD34+造血干细胞的功能至关重要［4］。目前的研究支持再障患者中存在自噬功能缺陷，但自噬基因缺陷型细胞如何影响其功能和定位仍有待阐明。

2.2 自噬影响造血干细胞的增殖分化及功能

造血干细胞（hematopoietic stem cells，HSC）在静止状态维系、更新和分化之间保持平衡，维持机体血细胞动态平衡，自噬对HSC 的长期存活、功能维持、抗原提呈、T 细胞分化和对细胞因子刺激的反应至关重要［14，15］。

自噬是HSC 自我更新的重要形式，干细胞中存在基础自噬现象，越不成熟、分化程度越低的HSPC自噬水平越高，自噬是维持干细胞静止状态的必要条件，干细胞静止期产生的细胞废物需要自噬来参与清除［16-18］。自噬保护HSC 免受代谢压力，可维持引起自噬的HSCs 的基因表达程序，而FOXO3A 是维持HSC 静止的重要转录因子，可调节HSC 的自噬，诱导包括Atg4b、Bnip3 等自噬基因表达，并在饥饿或生长因子缺乏时保护HSC 免受应激刺激，抑制HSC 的自噬可导致其活性缺陷，包括活性氧（ROS）水平增加，受损蛋白质、细胞器积累增多，致使HSC增殖分化能力及功能受损，破坏HSC 静止状态维持、自我更新和分化之间的平衡，从而导致造血障碍［16，19-21］。

HSPC 的增殖和分化受自噬的影响。再障患者的CD34+细胞自噬缺陷可致使CD34+细胞增殖分化能力降低，外周血及骨髓中CD4+CD25+Treg 数量均下降［14，22］。Gomez-Puerto 等［4］的研究证明脐带血来源的CD34+/CD38-未成熟造血祖细胞的自噬水平比CD34+/CD38+祖细胞更高，这种高自噬水平对于保持干细胞和前体细胞功能尤为重要，敲除基因Atg5 或Atg7，会使p53、Bax、PUMA 以及p21的表达增加和自噬减少，以致HSC 增殖分化以及进入细胞周期数均减少。可见，自噬是HSC 活性维持的重要调节机制，可减轻细胞应激，促进生存。

另外，自噬可通过多种途径降解并清除受损的线粒体，保持HSC 主要的糖酵解和静止状态，而HSC 自噬缺陷会导致线粒体积累和HSC 代谢状态的激活，损害HSC 的自我更新活性和再生潜能，而激活自噬能够维持HSC 的健康［23］。自噬对HSC 和祖细胞的增殖分化及功能保持尤为重要，其抑制可导致干细胞活性丧失，而在再障疾病发生过程中维持HSC 的自噬有助于降低干细胞衰竭，促进造血功能恢复。

2.3 自噬影响造血微环境的稳态

造血微环境稳态的破坏，会导致HSC 增殖分化及功能异常，致使再障的发生或进一步加重［5］。研究发现，再障中HSPC 数量减少，被早熟的脂肪细胞替代［24］，自噬缺陷可致IL-6 等造血负调控因子水平异常，而再障小鼠中IL-6 分泌增加，影响骨髓间充质干细胞（BMSCs）的成脂性平衡，骨髓中的血细胞减少而脂肪细胞增加，严重损害骨髓造血能力［25，26］。mTOR 是哺乳动物激活自噬通路的重要分子之一，而雷帕霉素（rapamycin）作为mTOR 的抑制剂，参与自噬激活。王昕等［27］的研究揭示雷帕霉素或许经过约束mTOR 信号通路而激活再障患者BMSCs 的自噬，降低其成脂分化，因而改善造血。再障患者中维持正常造血所必需的造血微环境结构完整性丧失，对HSC 增殖分化呈抑制作用［23，28，29］，而Chatterjee 等［30］研究发现活性氧的产生在再障骨髓细胞破坏中起核心作用，活性氧生成的增加不利于造血微环境稳态的维持，会致使骨髓再生不佳、骨髓脂肪细胞增加，造血微环境稳态失衡。而已有大量研究表明，活性氧水平增加与HSC 自噬缺陷有关［31，32］。造血微环境是HSC 及祖细胞的“土壤”，对HSC 的活性保持具有关键作用，造血微环境的破坏在再障的发病中发挥重要作用。

2.4 自噬影响免疫反应

再障是自身免疫功能紊乱性疾病，主要由异常激活的T 细胞及其分泌的细胞因子导致造血功能缺陷，和CD4+T 细胞亚群功能异常亢奋关系特别密切［6］。自噬在T 细胞的代谢、存活中占有关键地位，自噬可能通过影响免疫反应，从而影响骨髓造血，介导再障的发生进展。

2.4.1 自噬影响T 细胞的增殖分化 自噬对T 细胞成熟具有关键作用，可维持T 细胞稳态及调节T细胞分化和功能，自噬能通过向MHC 类分子提供细胞内抗原来调节T 细胞的生成和代谢［6，33-36］，特定自噬相关基因缺失会引起免疫改变，干扰T 细胞的分化，而CD4+和CD8+T 细胞的存活以及功能的正常维持离不开自噬［37-39］。自噬可协调T 细胞的代谢，再障患者中的CD4+/ CD8+T 细胞比率显著降低，活化增多的CD8+T 细胞抑制骨髓造血功能，导致骨髓破坏，而T 细胞依赖自噬间接以维持HSC 的代谢和分化，自噬抑制或缺失可致使HSC 的自我更新减少、静态性丧失以及淋巴和红系祖细胞数量减少，以致再障的发生及进展［33，40，41］。

2.4.2 自噬异常导致T 细胞亚群比例及细胞因子分泌失调 自噬影响T 细胞亚群比例及细胞因子产生和分泌，相应的，细胞因子又可反过来调节自噬功能。再障中Th17、Treg、Th1 和Th2 细胞分布异常，Th1 细胞分化及免疫功能紊乱、细胞数量异常增多，Th1/Th2、Th1/Th17 细胞比例显著升高，而Treg 细胞数显著削减，Treg/Th17 细胞比率下降［42，43］。自噬基因Atg7 或Atg5 是Treg 细胞必不可少的基因，而Treg 细胞性能的维持须要Foxp3，Atg7 缺陷的Treg 细胞凋亡增加，并且存在Foxp3 的表达缺陷，而自噬缺陷使mTORC1 活性增加、糖酵解代谢上调，从而导致Treg 功能缺陷［44］。再障患者的Treg 细胞比例显著下降，而下降Th1/Th17 细胞比例、升高Treg 细胞比率，调节Th17/Treg 细胞比率，能减轻再障患者的贫血症状［22，45-47］。

自噬可调节某些细胞因子的产生和分泌，并受其调节。T 细胞亚群比率失衡必然导致细胞因子产生和分泌水平的改变，如敲除Atg5 可导致CD4+T细胞中IFN-γ 分泌的减少，而TNF-α、IFN-γ 等造血负调控因子生成、分泌的增多可约束HSC 的活性、加速HSC 凋亡，进而影响再障的发生及进展［36，48］，因此，自噬对于HSC 的长期生存和功能是必不可少的。

3 自噬调控Treg 细胞在再生障碍性贫血的应用

当前，再障患者仍将造血干细胞移植或免疫抑制治疗作为首选，但存在治疗无反应、病情复发或恶化等并发症［1，45，49］。因此，寻找能提升再障患者存活率、生活质量的新策略尤为重要。再障患者外周血及骨髓中Treg 细胞有自噬缺陷，Treg 细胞功能缺陷、且数量显著缩减，功能关键基因Foxp3 表达减弱，以致效应T 细胞分泌TNF-α、IFN-γ 等造血负调控因子增加，而自噬在正常Treg 细胞中是活跃的，自噬对维系Treg 细胞性能完整占据关键地位，自噬相关基因的缺失会引起Treg 细胞过度凋亡、Foxp3功能下降，但自噬激动剂雷帕霉素可逆转此现象［50］。研究发现再障小鼠脾脏中Treg 细胞数量下降显著，Treg/Th17 比率降低，当归补血汤及当归多糖能够提高再障小鼠骨髓细胞线粒体膜电位，降低ROS，减少自噬泡产生，升高Treg 细胞比例，从而有效改良再障小鼠骨髓造血［51，52］。因此，调控Treg 细胞自噬，恢复Treg 细胞功能，可能是有效治疗或辅助治疗再障的新策略。

4 总结

一般情况下，持续基础低水平的细胞自噬可维持细胞的生理活动。因此，自噬可能在再障的发生进展中占据关键地位。再障是一种恶性血液系统病，其发生机制繁杂，当前普遍被认可的有种子学说、土壤学说、虫子学说，三者之间可互相影响，进而加速再障的发展。而近些年关于自噬影响造血干细胞增殖分化、造血微环境稳态、免疫反应从而影响再障的发生发展的研究越来越多。然而，目前关于自噬在再障发病中的具体作用和机制的探究仍需进一步完善，再障患者中HSC 存有自噬缺陷，其自噬水平显著降低，HSC 功能特性、干细胞静止状态、造血微环境稳态及免疫反应功能的保持遭到破坏。而作为一种治疗方法，自噬在维系Treg 细胞功能完整性具有不可或缺的调节作用，调控Treg 细胞自噬水平有望广泛应用于临床从而弥补或替代造血干细胞移植和免疫抑制治疗再障的不足，从药物毒性的角度来看，这对再障患者将有很大的益处。