骨桥蛋白在缺血性脑卒中发病中脑保护作用机制的研究进展

郭 群，任晓玉，张 琦，聂木兰，徐 璐，龙倩梅，郭一凡，王 东，刘 斌，何 玮，金银川

（1.滨州医学院，山东 烟台264000；2.滨州医学院附属医院，山东 滨州256600；3.第四军医大学，陕西 西安710000）

缺血性脑卒中是全球范围内居民死亡、致残的重要原因［1］，目前针对缺血性脑卒中的主要治疗方法是通过静脉溶栓恢复大脑血流［2］，但是这类治疗方法有严格的时间窗，仅有一部分患者能够在严格的时间窗内接受溶栓治疗［3］，并且溶栓治疗还可能带来再灌注损伤等问题［4］，因此通过药物或生物活性物质来保护缺血性脑卒中后的大脑尤为重要，但是目前各种神经保护药物或者生物活性物质的探索与运用仍然不足。近年来，骨桥蛋白在缺血性脑卒中发病中的神经保护作用逐渐引起了关注，本文综述了近年关于骨桥蛋白在缺血性脑卒中发病中脑保护作用及其机制的研究进展，希望促进对于骨桥蛋白脑保护作用及机制的研究，尽早阐明其作用机制及治疗运用方法，丰富针对缺血性脑卒中的脑保护药物或生物活性物质的选择，最终降低缺血性脑卒中的致死率、致残率。

1 概述

缺血性脑卒中是脑卒中最常见的类型［5］，是指各种脑血管病变所致脑部血液供应障碍，导致的局部脑组织缺血、缺氧性急性坏死，而迅速出现相应神经功能缺损的一类临床综合征［6］，主要损伤机制为在神经组织急性缺血缺氧的基础上继发神经细胞凋亡、氧化应激、炎症反应、血脑屏障破坏、免疫系统平衡失调等一系列级联反应，最终导致永久性局部神经组织坏死和神经功能缺损［7‐11］。骨桥蛋白（OPN）由分泌型磷蛋白‐1 基因表达［12］，是一种由314 个氨基酸组成的磷酸化糖蛋白，在肺、心、脑、骨等多种组织中表达［13］，同时在阿尔茨海默病、帕金森病、癫痫、脑卒中等多种神经系统疾病中发挥保护作用。OPN 含有一个RGD（精氨酸‐甘氨酸‐天冬氨酸）结合域、一个凝血酶切割位点、一个钙结合位点、两个肝素结合位点，其中OPN 主要通过RGD 序列结合αvβ3、αvβ5 等整合素与神经细胞等多种细胞相互作用，发挥保护、调节炎症、促细胞迁移等功效［14］，而凝血酶切割后则会暴露一个SVVYGLR 序列［15］，该序列可介导与α9β1，α4β1 和α4β7 整合素及CD44 受体的相互作用［16］，该序列的探索相对较少。

2 OPN 在缺血性脑卒中发病中脑保护作用机制的研究进展

目前针对缺血性脑卒中脑保护的策略主要从抗炎、促进胶质细胞增值、促血管新生、保护血脑屏障等角度切入，既往研究显示，在缺血性脑卒中发生后的3～24 h 内，骨桥蛋白在梗死核心和梗死周围区域的小胶质细胞和巨噬细胞中被诱导，并在第7天达到高峰，通过促使小胶质细胞极化向保护性M2 表型转变、减轻神经炎症、血运重建、诱导可塑性等途径影响脑梗死体积、急性期神经功能状态和远期预后［17，18］，也有研究认为，相对于炎症因子等，骨桥蛋白的表达较晚，可能在形成新屏障等组织重塑中作用更为明显［19］。

2.1 抗炎

缺血性脑卒中发生后，由于缺氧、缺血等损伤导致神经系统内环境改变，致使小胶质细胞、内皮细胞等进入应激状态，这些细胞活化后释放各种炎性细胞因子，比如白细胞介素‐6（IL‐6）、组织坏死因子‐α（TNF‐α）等，这些炎性细胞因子除了本身的细胞毒性以外，还诱导选择素等黏附分子的表达，而黏附分子则诱导白细胞迁移、聚集，导致血栓形成加快，并且聚集而来的白细胞可以释放更多的炎性介质，如诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和基质金属蛋白酶（MMP），进一步加重脑血流阻塞并促进血脑屏障（BBB）的损伤；随着BBB 的损伤，外周循环中的单核/巨噬细胞可募集到缺血脑组织中，其中的MMP2、MMP9 以及氧自由基（ROS）等细胞毒性物质都会进一步继续损害血脑屏障，最终导致外周的白细胞大量浸润脑实质伴随更大量的炎症介质释放，整个过程呈级联式不断加重脑损伤［20，21］。因此，炎症是缺血性脑卒中的重要病理生理环节，并与缺血性脑卒中的远期预后有关［22］。现在也有一些抗炎药物的研究，比如阻断细胞因子的IL‐1 阻断剂（戊硫氧嘧啶）、TNF‐α 阻断剂、神经肽类等，但是均效 果 欠 佳［23，24］。骨 桥 蛋 白 的 早 期 研 究 中，Meller等［25］给予缺血性脑卒中大鼠外源性OPN，发现大鼠脑缺血的面积减少，并可能是通过整合素受体发挥作用，Jin 等［26］在进一步研究中发现含有RGD 序列的OPN 具有良好的减轻缺血性脑卒中梗死面积的作用，并且缺血半球中TNF‐α、IL‐1β 等炎性物质被显著抑制，而当在RGD 序列组加入抗αvβ3 抗体或者使用RGD 变异序列时，上述抗炎作用则明显消退。这些结果表明，含有RGD 的OPN 通过αvβ3 整合素发挥抗炎作用。但是，Chung 等［27］发现，大脑在缺血性脑卒中后的第4～8 周会迎来第2 次的炎症爆发，而在这个过程中，OPN‐/‐小鼠（OPN 基因敲除的小鼠）的梗死区域中MMP 等相关炎症因子的表达反而显著降低，并且继发性神经减退的程度也较低，具体表现为梗塞区域神经元保留较多、运动功能恢复更快等。其原因可能为脑梗死区域吞噬细胞不能有效清除富含胆固醇的髓鞘碎片造成大量胆固醇晶体存在进而导致OPN 表达升高持续促进慢性炎症所致，但是具体的机制仍未阐明。所以，对于骨桥蛋白的抗炎作用及机制尤其是作用时效仍需进一步研究。

2.2 促小胶质细胞迁移与运动

在中枢神经系统中，小胶质细胞在免疫和炎症反应中均发挥重要作用。虽然生理条件下大多数小胶质细胞保持静息状态，但是即使是微小的病理刺激，小胶质细胞也会被迅速激活，成为中枢神经系统（CNS）损伤后最早反应的细胞。激活后的小胶质细胞涉及增殖、迁移至损伤部位、免疫调节剂表达增加以及转化为吞噬细胞等，活化的小胶质细胞也通过释放细胞因子、一氧化氮（NO）和ROS 等促炎性因子介导神经元的损伤［28，29］。因此小胶质细胞在神经系统损伤中发挥双重作用，即促炎型（M1）和 抗 炎 型（M2），M1 倾 向 于 释 放TNF‐α、iNOS、IL‐1β 等破坏性介质；M2 产生有益的介质，如IL‐4、转化生长因子‐β（TGF‐β）等［30］。因此，促使小胶质细胞的迁移、增殖及向M2 型的转化极为重要。以往的研究一般使用姜黄素、丹皮酚、miRNA124 等来促进小胶质细胞的表型转化［29，31，32］，但均效果欠佳。随着研究的进一步深入，Ladwig 等［33］发现在缺血性脑卒中发病中，OPN 可以促进小胶质细胞向M2 表型的表达，并且可以降低M1 型小胶质细胞iNOS 的表达。同时发现M1 和M2 表型小胶质细胞往往互相重叠，而骨桥蛋白可以促进M2 表型的小胶质细胞从重叠区域分离，并且这种M1 和M2 型小胶质细胞的分离可能对卒中后的结局是有益的。其他研究也发现，OPN 可以增加应激状态下小胶质细胞的存活，并且抑制小胶质细胞超氧化物生成甚至可以直接清除氧自由基，但是在OPN 与小胶质细胞的迁移、吞 噬 等 方 面 未 发 现 明 显 促 进 作 用［34，35］。Kim等［36］却有了新发现，他们发现含有RGD 和SLAY基序的OPN 可以明显增强BV2 细胞（小胶质系的一种）的吞噬能力，并可以增强BV2 细胞的运动速度、伪足长度等指标，同时与细胞运动有关的F‐肌动蛋白的强度及阳性区域均显著增加［37］。因此骨桥蛋白可能通过小胶质细胞发挥脑保护作用。

2.3 促神经干细胞迁移

神经干细胞（NSCs）是一种多潜能细胞，具有很强的自我更新能力并可分化为神经元、星形胶质细胞等。内源性神经干细胞广泛存在于脊髓齿状回颗粒下区、脑室下区等。在缺血性脑卒中发生后，这些特定区域的神经干细胞急剧上调，并且通过受损组织所释放的趋化因子迁移至梗死核心，随后分化为受损类型的神经细胞，这种迁移在缺血性脑卒中治疗中非常重要，因为损伤部位原有的神经干细胞无法支持功能修复，而迁移来的NSC 除了分化以外还可以分泌适当数量和类型的信号因子，持续影响缺血区域的微环境，因此也有助于对缺血性脑卒中损伤做出个性化反应［38，39］。既往研究一般使用外源性神经干细胞进行静脉或者经脑实质的移植，并观察到外源性神经干细胞移植后可促进内源性神经干细胞增殖和迁移，抑制炎症、促进突触重塑、刺激新血管形成，这一过程可能是与分泌一些神经营养因子有关。虽然外源性神经干细胞对于缺血性脑卒中有一定治疗作用，但由于伦理、治疗效果和安全性问题，外源性NSC 移植疗法仍距离临床应用阶段非常遥远［38，40］。除此之外，也有研究试图使用重复经颅磁刺激等手段来促进缺血性脑卒中后神经干细胞功能的分化，但效果欠佳［41］。虽然内源性神经干细胞的迁移对于缺血性脑卒中发病区域的治疗非常重要，但是这种迁移对于严重的大脑损伤来说远远不够［42］。Rogall 等［43］使用DCX‐luc转基因小鼠（这种小鼠可以通过腹腔注射荧光剂使大脑呈现荧光状态，并使神经干细胞的迁移呈现“热点”状态，便于观察［44］）造模，结果发现OPN 治疗后的NSC 的迁移距离及扩展数量极大地增加，并且在第7～28 天增强较为明显。在类似研究中，Ra‐benstein 等［45］在给予缺血性脑卒中动物模型OPN 的同时加入G 蛋白偶联受体4（CXCR4）的阻断剂AMD3100，而CXCR4 一直被认为与神经干细胞的迁移有密切关系［46，47］，结果发现阻断CXCR4 可以完全消除OPN 对NSC 的迁移诱导。总之，骨桥蛋白对于神经干细胞的迁移可能有密切关系，还可能与CXXR4 受体有关，并因此起到脑保护的作用。

2.4 促进血管生成

缺血性脑卒中所致神经元凋亡的严重程度往往取决于脑血流量减少的时间，因此促进缺血性脑卒中后梗死区域的血流恢复对于恢复梗死区域的供血、供氧，减少神经元凋亡非常重要［48］。但是，如前文所述，并不是所有患者都能及时接受再通治疗，因此通过药物等促进血管生成逐渐引起了更多的关注。血管生成是一个多步骤的过程，涉及内皮细胞增殖、迁移、管形成、分支和吻合等［49］。许多生长因子与这一过程有关，包括血管生成因子（VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（FGF2）、脑源性神经营养因子（BDNF）等［50］。目前的促血管生成的手段主要包括：（1）药物：比如芬戈莫德［51］；（2）细胞因子：如VEGF、FGF2 等，尤其是VEGF 比较多见，但是VEGF 有着引起血管通透性增加、导致渗漏的风险［52］；（3）其他：比如miRNA、重复的颅脑磁刺 激 等 等，但 均 效 果 有 限。Lee 等［53］发 现 使 用 含RGD 和SLAY 两种基序的OPN 治疗缺血性脑卒中大鼠，其脑梗死灶中的血管长度显著增加（对照组的226.1%±11.2%），并且OPN 治疗大鼠的缺氧明显减轻。同样是加用抗αvβ3 整合素抗体后可以降低这种改善，表明OPN 的RGD 和SLAY 基序与αvβ3 整合素的结合在促进缺血性脑卒中后脑血管生成中发挥重要作用，当然，这两种基序是否同样重要仍需进一步研究。

2.5 修复血脑屏障

血脑屏障（BBB）属于神经血管单元，由内皮细胞、周细胞、星形细胞末端足和基底膜组成［54］，其中星形细胞突起几乎完全包裹脑毛细血管并覆盖于血管腔外内皮细胞的表面［55］，同时星形胶质细胞的末端表达大量的ATP 敏感性钾通道，并且水通道蛋白‐4（AQP4）在星形胶质细胞末端大量表达并定位，以此来调节细胞内外钾通量及大脑与循环之间的水通量，此外星形胶质细胞释放如胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）、NO 等化学物质以发挥营养神经元、神经递质清除和再循环、调节BBB 的作用［55‐57］，因此星形胶质细胞对于BBB 的结构和功能的完整非常重要。当缺血性脑卒中发生后，由于MMPs 的产生导致细胞间紧密连接遭到破坏，血脑屏障丧失其结构的完整性，进而导致大量的神经毒性物质、大分子、炎性细胞等渗入脑组织，同时BBB功能障碍可进一步导致血管源性水肿形成和出血性转化，最终会加速神经损伤和认知障碍［58］。目前保护血脑屏障的治疗主要是药物治疗如抗MMPs的抗坏血酸、丙泊酚等，抗炎的黄体酮等，以及低温治疗等方法，但是效果仍不理想［59］。既往一些研究发现骨桥蛋白在血脑屏障功能受损的血管中表达增加［60］，在进一步的研究中，Gliem 等［61］通过追踪AQP4 以观察星形胶质细胞的分布情况，结果发现，在OPN‐/‐的缺血性脑卒中模型中，AQP4 的表达相对野生型小鼠下降，并且OPN‐/‐小鼠的星形胶质细胞主要表达于梗死区域外围，未能向病变核心延伸其突起，同时正常表达大量AQP4 的星形胶质细胞末端未能充分覆盖新生血管，由于梗死核心区域缺少功能正常的星形胶质细胞，血脑屏障持续渗漏。因此，骨桥蛋白对于血脑屏障的重建可能有着重要作用，但是相关研究仍需完善。

3 展望

随着生物科技的不断发展，各种制药技术也不断进步，Jin 等［62］研究发现使用明胶微球作为OPN的载体通过快速、持续的释放方式可以增强其神经保 护 作 用，而Joachim 等［63］进 一 步 制 造 了 可 携 带OPN 的明胶纳米颗粒（GNP），并且证明了这些携带OPN 的GNP 在鼻内给药后拥有良好的进入脑实质、发挥脑神经元保护的能力。

总之，骨桥蛋白是一种效果理想的缺血性脑卒中的神经保护蛋白，随着其保护机制的研究深入及运用手段的不断成熟，相信可以在临床治疗中更好应用。