辅助生殖技术对胎盘形态和功能的影响及其相关机制

王明，金妮，芦洁，陈书强，李博

辅助生殖技术(assisted reproductive technology, ART)是指以治疗不孕不育症为目的而采取的一切在体外操作配子及胚胎的治疗手段或方法[1]。自1978年第1例“试管婴儿”诞生，全世界已有600多万试管婴儿出生，试管婴儿群体已成为新生人口的重要组成部分[2]。虽然ART的各项技术不断优化完善，但由于体外环境与体内生理环境存在极大的差异，ART作为一种医源性非生理操作是否会对配子及胚胎造成环境应激，进而诱发不良妊娠结局并增加子代出生后健康风险，一直是生殖学家们探究的焦点[2-3]。流行病学研究表明，与自然妊娠相比，ART导致流产、早产、低出生体重、小于胎龄儿等不良妊娠结局发生风险显著升高，ART出生的子代发生出生缺陷的风险增高30%[4-5]。利用小鼠作为动物模型研究发现，ART导致子代出生体重显著下降，并影响子代心血管系统的发育，导致血管功能异常[6]。

胎盘是胎儿在宫内发育期间联系母体和胎儿的枢纽，负责母胎之间物质交换，可将营养物质、氧气等从母体转运至胎儿，在胎儿的生长发育中扮演着至关重要的角色[7]。胎盘结构及功能异常对母体和胎儿都会造成损害，比如胎盘发育不全、体积缩小会导致胎儿发育不全或胎儿宫内生长受限[7-8]。此外，胎盘功能异常还会通过影响胎儿器官的发育造成子代成年后代谢性疾病的发生风险增加[9]。鉴于胎盘在妊娠过程中的重要作用，本文将对ART诱发的胎盘形态和功能异常，及其相关的调控机制进行详细综述。

1 辅助生殖技术致胎盘的发育及功能异常是一种普遍现象

由于ART操作中体外环境与母体生理环境存在极大的差异，使用促排卵药物会对配子和胚胎的发育潜能、子宫内膜容受性及母体健康产生负面影响，导致妊娠期胎盘发育异常。在辅助生殖临床中，大量研究证实ART会影响胎盘的正常发育与功能[10]。流行病学调查表明，ART致妊娠后期胎盘重量显著增加，胎儿低出生体重的发生率显著升高，且胎盘重量与胎儿重量的比值显著增加[5,11]。病理学检查发现，ART致胎盘的厚度增加，且胎盘血肿的发生概率显著升高[12]。镜检显示，ART受孕的胎盘绒毛水肿及微钙化的发生概率显著升高[13]。通过胎盘超微结构研究发现，ART导致胎盘屏障厚度显著增加，绒毛血管密度下降、血管形态明显异常，限制了营养物质的跨胎盘运输[14]。分子生物学研究发现，ART受孕胎盘中可溶性血管内皮生长因子受体可溶性fms样酪氨酸激酶受体-1(soluble fms-like tyrosine kianse-1,sFlt-1)表达上升，而胎盘血管内皮生长因子和胎盘生长因子(placental growth factor，PLGF)表达下调，且ART受孕胎盘的蛋白质组、转录组和DNA甲基化组与自然妊娠的胎盘均存在显著差异[15-18]。小鼠模型中发现，ART导致小鼠妊娠末期胎盘过度生长、海绵滋养层与迷路滋养层分离异常，胎儿重量显著降低，且胎盘葡萄糖和氨基酸转运能力下降[19-20]。ART还导致小鼠胎盘的类固醇代谢异常，影响类固醇的转运[21]。利用山羊作为动物模型也发现，ART影响胎盘DNA甲基化酶的活性，并导致胎盘中血管数量减少且管腔狭窄，血管生成严重受损[22-23]。上述结果表明，无论是人类还是动物模型，ART致胎盘发育及功能异常，并进一步导致不良妊娠结局的发生风险增加是一种普遍现象。由于胎盘发育及功能异常不但影响围产期新生儿健康，还会导致子代长时程的健康风险增加，因而揭示ART导致胎盘形态与功能异常的相关发生机制，则显得尤为重要。

2 印记基因在胎盘生长发育中的重要作用

印记基因是指仅有一方亲本来源的同源基因表达，而来自另一亲本被表观遗传学修饰后沉默的一类特殊基因群体[24]。随着越来越多的印记基因在胎盘中被发现，其在胎盘生长发育中的显著调控作用被逐渐证实。研究表明，印记基因不仅通过调控滋养层细胞的增殖和分化，参与胎盘的形态构建，还参与调控胎盘葡萄糖与氨基酸等营养物质的转运，脂质类代谢物的合成，从而影响胎儿的宫内生长和出生体重[24-26]。印记基因在胎盘中的表达具有时间调控性，随着妊娠过程的持续，其表达状态呈现动态改变，一旦表达失调就会导致胎盘发育缺陷。有研究表明，印记基因Sfmbt2缺失，会导致胎盘滋养层的发育严重缺失，继而造成胚胎发育停止[24]。通过基因敲除的方法也已经证实印记基因(Ascl2、Phlda2和Peg10等)在小鼠胚胎滋养层细胞的增殖、分化及胎盘血管生成、营养物质转运等方面的重要作用[24,27]。印记基因的“两性斗争假说”认为父源印记基因可促进胎儿和胎盘的生长，让携带自身基因组的胎儿受益，而母源印记基因则倾向于限制性地向胎儿提供营养，以孕育更多的子代[28]。相关研究也显示，敲除参与胎盘发生的父源印记基因Igf2和Peg3后会导致胎盘体积缩小，胎儿出生体重降低，而敲除母源印记基因H9和Grb10可造成胎盘过度生长、胎盘迷路层形态异常等现象[24-25，27]。说明印记基因在胎盘发育过程中扮演着不可或缺的重要角色。

3 辅助生殖技术致印记基因紊乱是导致胎盘发育及功能异常的重要原因

胎盘印记基因的印记和表达极易受外界环境的干扰。ART作为一种医源性环境应激，卵母细胞的体外培养与受精、胚胎转移、胚胎冷冻、体外高氧浓度培养环境等均可影响配子及植入前胚胎印记基因的印记表达[29]。在胚胎植入后，大量卵母细胞来源的DNA甲基化在胎儿组织中被擦除，而在胎盘组织中继续保留，这些特殊的卵母细胞DNA甲基化位点被称为 “胎盘特异性母源甲基化”[30]。控制性超促排卵是ART操作中的关键技术步骤之一，会造成体内雌激素水平远超生理状态。临床样本及动物实验均发现，促排卵的高雌激素水平会导致卵子中Snrpn、Peg3、Kcnqlot1等基因甲基化水平显著降低，进而导致胎盘母源基因甲基化水平降低，胎盘海绵滋养层与迷路滋养层的界限扭曲、胎盘效率显著降低[31]。小鼠研究还发现，胚胎体外培养会增加胎盘组织中印记基因的随机表观遗传错误的频率，玻璃化冷冻操作会导致受孕后胎盘组织印记基因H19表达紊乱[32-33]。利用小鼠模型对植入后胚胎进行研究发现，ART导致的印记紊乱选择性地存在于胚胎外组织(胎盘和卵黄囊)，而胎儿组织并不存在印记紊乱[20, 32, 34]，说明相对于胎儿组织，胎盘组织的印记基因更易受到ART操作的影响。本课题组前期研究也证实，ART不影响胎鼠组织中印记基因的表达水平，但会导致胎盘组织中印记基因H19、Snrpn、KvDMR1、Peg3、Kcnqlot1及Plagl1甲基化水平显著降低以及重复序列缺失[20, 34]。印记基因的正确表达是保证胎盘正常发育的基本要素，ART操作会影响胎盘印记基因的印记状态(DNA甲基化、组蛋白修饰及染色质重塑)，引起印记基因表达紊乱，这可能是诱发胎盘发育及功能异常的重要原因，揭示ART致胎盘发育与功能异常的印记基因，并阐明其作用机制，是当前辅助生殖领域的研究热点。

4 Akt信号通路过度激活可能是辅助生殖技术干扰胎盘生长发育的重要途径

Akt信号通路在细胞中广泛存在，主要通过调控基因转录和蛋白合成来调控细胞的生长、增殖、分化及凋亡等生理过程[35]。Akt信号通路作为控制细胞增殖的核心，与胎盘生长发育调控具有不可忽视的联系。有研究报道，ART操作会导致小鼠胎盘中Akt蛋白磷酸化水平显著升高[21,36]。葡萄糖和氨基酸作为重要的营养物质，其缺乏会对胎盘和胎儿生长发育造成严重影响。研究发现，抑制胎盘Akt信号会显著降低胎盘中葡萄糖和氨基酸转运体表达丰度及活性，导致新生儿出生体重显著降低[37]。本课题组前期检测小鼠妊娠末期胎盘脂质谱发现，ART胎盘中磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、溶血磷脂酰胆碱、线粒体心磷脂水平均显著升高；胎盘中Akt磷酸化水平和调节脂类生物合成的蛋白酶SREBP1含量也显著升高[21]。提示ART可能通过激活Akt信号通路触发下游的SREBP1激活，进一步诱导脂质生物合成相关酶类的表达，造成胎盘中脂质异常积累。此外，研究报道Akt信号通路可参与糖类和脂质的代谢调控，通过负调控GSK3β促进糖原的合成和积累，并通过调控FoxO1促进葡萄糖和脂质的合成[35]。我们推测，ART助孕导致的胎盘中Akt信号通路过度激活，进而诱使胎盘细胞异常增殖、糖原和脂质异常积累，是干扰胎盘发育的重要途径。

5 辅助生殖技术通过影响印记基因H19表达，进而调控胎盘生长发育的可能机制

H19是最早被鉴定的调控胎盘生长和胚胎早期生长发育的母源印记基因，在胎盘中含量丰富，H19表达缺乏会导致胎盘各层组织异常增生，迷路层体积以及糖原细胞数目增加，胎盘转运效率降低[20]。小鼠研究发现，妊娠中期ART胎盘中H19表达水平与自然妊娠胎盘相比显著上调，胎盘重量降低；而妊娠末期ART胎盘中H19表达却显著下调，胎盘重量显著增加，说明H19在孕期胎盘中表达呈波动性，ART可能通过干扰印记基因H19的表达来调控胎盘的生长发育[34]。H19基因下游存在H19/Igf2共用的转录增强子，两者存在表达竞争关系，当H19表达受到抑制时，转录增强子与Igf2启动子相互作用启动转录，Igf2表达上调[38]。Igf2作为一种多功能细胞增殖调控因子，在细胞分化和增殖中具有重要的促进作用[38]。本课题组前期利用小鼠模型发现，ART导致妊娠末期胎盘中H19表达下调，Igf2及其受体结合蛋白表达均上调，进而激活了下游的Akt信号通路，造成胎盘过度生长[36]。关于其调控机制有研究报道，ART可导致胎盘中甲基化转移酶Dnmt3b的表达水平上调，使H19印记控制区发生过甲基化，引起H19表达下调，进而诱发下游相关调控反应[20,36]。

6 辅助生殖技术通过影响印记基因Phlda2表达，进而调控胎盘生长发育的可能机制

Phlda2也是母源印记基因，在调控胎盘发育和胎儿宫内生长等方面具有重要作用。对小鼠不同妊娠阶段胎盘中Phlda2表达模式进行系统分析发现，在妊娠中期，ART致小鼠胎盘重量显著降低，Phlda2的表达水平显著升高；但在妊娠末期，胎盘重量显著增加，糖原异常积累，Phlda2的表达水平显著降低，显示Phlda2的表达水平与胎盘生长呈负相关趋势[20, 34]。在人类临床研究中发现，与自然妊娠相比，ART助孕胎盘中印记基因Phlda2 mRNA表达水平和蛋白水平均显著降低，葡萄糖转运体GLUT1和GLUT3表达水平却显著升高[39]。与野生型小鼠相比，Phlda2功能缺失型小鼠的胎盘重量和胎盘糖原量都显著增加，胎鼠体重却明显降低，表明胎盘中过多的糖原积累都是以胎儿生长为代价的[40]。那么ART是如何通过影响Phlda2表达而调控Akt信号通路的？已知Akt蛋白具有一个PH结构域，此结构域是一个脂结合原件，可与细胞内重要的脂质信号分子3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)相结合而被激活[41]。而Phlda2蛋白同样具有PH结构域，可通过与PIP3结合固定在质膜上[42]。研究表明，Phlda2可与Akt竞争性结合PIP3，Phlda2过表达会竞争性抑制Akt信号通路的磷酸化激活；而Phlda2低表达会过度激活Akt信号通路[41]。因而，胎盘中Phlda2的表达变化可能是对ART操作产生的应激响应，低表达的Phlda2对Akt的竞争性抑制作用下降，Akt信号通路过度激活，细胞增殖异常，营养物质过度积累，最终造成胎盘形态和功能异常。

7 利用小分子药物挽救辅助生殖技术胎盘功能，改善试管婴儿妊娠结局

利用小分子药物，干扰胎盘相关信号通路以挽救胎盘功能，进而为妊娠过程中胎儿的生长发育提供良好的保障，是一种新型治疗方法。研究发现，对于宫内生长受限的胎儿可以通过添加香豆雌酚激活胎盘中Akt信号通路，提高胎盘转运功能，改善胎儿发育状况[43]。而孕妇肥胖会导致胎盘Akt信号通路过度激活，致使胎盘转运氨基酸能力增强，胎儿出现过度生长[44]。在小鼠模型中，利用Akt信号通路抑制剂脂联素可有效干预肥胖孕鼠胎盘的功能，恢复正常的胎盘胰岛素信号和营养转运，有效挽救胎儿过度生长的表型[44]。小分子MK-2206和SC79是基础研究中常用到的活体动物Akt信号通路抑制剂和激活剂，其安全性和有效性已经过大量研究的证实，可安全有效地抑制或者激活胎盘Akt信号通路[45-46]。因此，利用Akt抑制剂和激活剂干扰胎盘Akt信号通路，探索通过母体补充小分子药物来逆转ART胎盘功能异常，将会为临床干预和防治ART导致的妊娠并发症及胚胎源性疾病提供理论及实践支持。

综上所述，ART虽然解决了很多家庭不孕不育的难题，但是该技术仍存在诸多不足。ART操作导致胎盘的生长发育与功能异常，为子代健康带来极大的风险隐患。在动物模型和人类中均已证实，胎盘中Akt蛋白的活性与胎盘的生长呈正相关。ART胎盘中印记基因表达紊乱可能是过度激活Akt信号通路，导致细胞异常增殖、糖原和脂质异常积累，胎盘过度生长功能异常的重要原因。尽管有研究表明ART操作会影响印记基因的表达，但其具体表观遗传学调控机制尚未明确，还需要更深入的探究。如果我们能够找到明确的调控机制，用于改善ART对胎盘生长发育的影响，保障试管婴儿的健康，这才是探究ART安全性的最终目标。