结核IgG 抗体检测、T-SPOT 及痰结核分枝杆菌核酸检测对骨关节结核的诊断价值

鄢志辉，孙 立，简月奎

（贵州省人民医院骨科，贵州 贵阳 550002）

骨关节结核（osteoarticular tuberculosis）可引起严重的骨质破坏，出现关节或脊柱畸形，导致患者关节功能丧失或肢体功能障碍，早期的诊断及治疗至关重要[1-4]。结核分枝杆菌的培养检测是诊断结核病的金标准，但培养时间长[5]，而临床急需能快速诊断的检测技术。骨关节结核诊断的检测技术众多，外周血结核感染T 淋巴细胞斑点试验（T-SPOT）在辅助诊断结核患者的敏感性高，但是特异性低；血清结核分枝杆菌IgG 抗体（IgG 抗体）和痰结核分枝杆菌核酸检测敏感性低。有研究发现IgG 抗体检测技术准确度低，误诊率和漏诊率较高，建议临床不应继续使用[6]。目前这三种检测技术的临床价值存在争议[6-9]。本研究回顾性分析三种检测技术的敏感性和特异性，比较在骨关节结核诊断中的临床价值，为骨关节结核诊断提供临床参考，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 回顾性分析2017 年1 月～2018 年10月在贵州省人医院骨科确诊为骨关节结核患者病例资料。纳入标准：病理结果诊断为骨与关节结核或根据临床病例资料，经正规抗结核治疗有效的患者。排除标准：合并布氏菌感染者；合并患恶性肿瘤者；免疫缺陷性疾病者或采用免疫抑制药物史；正规抗结核治疗后无法确诊的病例及活动性肺结核患者。符合研究标准的患者共有196例患者，其中男性110例，女性86例；年龄11～84 岁，平均年龄42.00 岁。脊柱结核患者155例，关节结核患者41例。选取同时期非结核患者共69例，作为对照组；其中男性38例，女性31例；年龄7～73 岁，平均年龄为52.30 岁。患者都在检验科完善外周血T-SPOT、血清结核IgG抗体及痰TB-DNA 三种检查。

1.2 方法

1.2.1 结核感染T 淋巴细胞斑点试验 真空采血管采取外周血5 ml，放入15 ml 无菌离心管，加1640 培养液至10 ml，加入到淋巴细胞分离液，18 ℃2300转离心22 min。将单个核细胞层从Ficoll 分离管中转移到15 ml 尖底离心管，加入RPMI 1640 培养液至10 ml，18 ℃1900 xg 离心7 min。离心后去除上清，加入RPMI 1640，轻缓重旋细胞沉淀，加入1640培养液至10 ml，18 ℃1300 xg 离心7 min。再去除上清，加入0.5 ml AIM-V 培养液重旋细胞。1.5 ml离心管中加入10 μl 已制备样品细胞悬液和40 μl的0.4%台酚兰，制备1∶5 细胞稀释液；取10 μl 台酚兰/细胞混合悬液加入血细胞计数板并进行活细胞计数。试剂盒来自上海复星长征科学有限公司。根据抗原A 和B 孔的反应判断结果：当阴性对照孔斑点数为0～5，阳性样本应为：（抗A 或抗B 斑点数）-（阴性对照孔斑点数）≥6；当阴性对照孔斑点数≥6，阳性样本应为：（抗原A 或抗原B 斑点数）≥2×（阴性对照孔斑点数）。如果阳性对照孔结果良好，但抗原A 或抗原B 均达不到阳性样本判断标准，则结果为阴性。

1.2.2 结核分支杆菌IgG 抗体检测 结核分枝杆菌IgG 抗体检测试剂盒由芯片和试剂两部分组成。芯片字系统为：TBO1A，采用南京大渊生物技术工程有限责任公司生产的PBT-X4 型生物芯片识别仪分析。无抗凝真空采血管采集静脉血清样本，体积不少于150 μl。离心1000 rpm，10 min，吸取上清检测；芯片上标记样品编号，在芯片盒窗口内滴加200 μl 2%吐温和Tris 缓冲液，使膜表面完全浸湿，室温放置1 min，加检测血清100 μl；血清完全渗入后，滴加300 μl 2%吐温和Tris 缓冲液；完全浸入后，滴加金标抗人IgG 500 μl；待完全浸入后，滴加2%吐温和Tris 缓冲液300 μl。反应完毕30 min 内，将芯片和校正光盘分别放入生物芯片识别仪内检测。结核分枝杆菌脂阿拉伯甘露聚糖（LAM），结核分支杆菌16KD 蛋白（16KD） 和结核分枝杆菌38KD 蛋白（38KD）抗原的IgG 抗体有任何一指标为阳性时，该检测方式结果为阳性。

1.2.3 结核分枝杆菌核酸PCR 检测 清晨取肺深部咳出的痰液，至少5 ml。采用中山大学达安基因股份有限公司生产的结核分枝杆菌核酸检测试剂盒。利用体外扩增法检测结核分枝杆菌DNA。向玻璃管中加入4倍体积的4%NaOH，摇匀，室温放置20 min 待液化；取液化后标本1.5 ml 离心管，12000 rpm 离心5 min；去上清，沉淀加灭菌生理盐水1 ml 混合均匀，12000 rpm 离心5 min；去上清，沉淀加灭菌生理盐水1 ml 混合均匀，12000 rpm 离心5 min；去上清，沉淀中加入50 μl DNA 提取液充分混合均匀，100 ℃恒温处理10 min，12000 rpm 离心5 min。通过ABI Prism 7500 操作检测。阴性质控品为增长的曲线不呈S 型曲线或Ct 值=30；阳性质控品为增长曲线呈S 型曲线，且强阳性质控品定量参考值在1×106～2.0×107基因拷贝/ml 范围。

1.3 观察指标 观察并记录结核IgG 抗体、T-SPOT及痰TB-DNA 的敏感性和特异性；其中敏感性为真阳性/（真阳性+假阴性）×100%，特异性为真阴性/（真阴性+假阳性）×100%。比较各种检测方式的敏感性和特异性。

1.4 统计学分析 采用SPSS 20.0 统计学软件分析，计数资料以（n，%）表示，组间比较采用χ2检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三种检测技术敏感性比较 三种检测技术对196例骨关节结核患者的敏感性，T-SPOT＞结核IgG 抗体＞痰TB-DNA，差异有统计学意义（χ2=252.94，P=0.000）。

表1 三种检测技术敏感性比较（n，%）

2.2 三种检测技术特异性比较 三种检测技术对69例骨关节结核患者的特异性，痰TB-DNA＞结核IgG抗体＞T-SPOT，差异有统计学意义（χ2=28.670，P=0.000）。

3 讨论

骨关节结核起病隐匿，缺乏典型的全身结核中毒症状，早期的诊断和治疗不及时，可引起严重的骨质破坏，具有较高的致残率[10-13]。研究显示[9]，T-SPOT检测肺外结核患者的敏感性为90%，本研究发现三种检测技术中，T-SPOT 在辅助诊断骨关节结核患者中的敏感性高，为90.82%。本研究结果与既往研究相似。有研究显示[14-16]，T-SPOT 检测结核患者的总敏感性波动在76%～89%，另有文献报道[17]，引起T-SPOT 检测假阴性的高危因素有高龄，体重指数超过25 kg/m2，病程超过6 个月等。本研究发现T-SPOT 检测骨关节结核出现18例假阴性患者。这18例患者中，有6例患者年龄超过60 岁，与研究报道结论一致。还有4例患者因胸椎或腰椎结核术后取内固定住院，入院后发现T-SPOT 检测为阴性；这有可能是患者结核病灶治愈或体内结核分枝杆菌数量甚微，未引起特异的效应T 淋巴细胞，导致检测技术非阳性。

结核分支杆菌IgG 抗体检测技术是定性检测人血清样本中结核分支杆菌16 KD 蛋白，脂阿拉伯甘露聚糖和38 KD 蛋白抗原的IgG 抗体。该检测技术的核心是通过检测免疫复合物。在骨关节结核患者体内持续存在结核分枝杆菌分泌抗原，与体内的抗体特异性结合，产生免疫复合物，所以IgG 抗体检测技术特异性较高。Bai XJ 等[18]回顾性分析2549例结核患者病例资料，发现IgG 检测技术是一种经济且快速辅助诊断结核病的方式，尤其是在肺外结核患者中。但由于骨关节结核患者长期慢性消耗，免疫力可能低下，加之抗结核药物治疗，体内结核分支杆菌含量减少，影响特异性抗原分泌，故敏感性不高。

痰结核分枝杆菌核酸PCR 检测的敏感性最低，只有13.27%。其原因有为本研究排除了合并有活动性肺结核的患者，且骨关节结核患者中肺部阳性结核分支杆菌的数量少，标本中结核分枝杆菌的活性差或数量少，难于出现阳性结果。此外，有文献报道[19]，结核治疗会迅速减少痰中结核分枝杆菌的数量。本研究中手术患者术前已正规抗结核治疗至少2 周，有可能影响痰中结核分枝杆菌菌落数量，导致该检测结果为阴性。这三种检测技术辅助诊断骨关节结核患者的敏感性和特异性有差异。其中T-SPOT 检测的敏感性最高，为90.82%，但T-SPOT 检测特异性较低，故临床工作中还需结合多种检测技术。本研究具有一定的局限之处，这是一项回顾性研究，非结核组患者及T-SPOT 检测的假阴性骨关节结核患者的样本量过少。所以在后续的研究中，增加样本量，设计前瞻性对照研究，进一步探讨三种检测技术在骨关节结核患者诊断的临床价值。

综上所述，三种检测技术的敏感性和特异性有显著差异，其中T-SPOT 检测敏感性最高，痰TBDNA 特异性最高，在快速诊断骨关节结核还需结合多种检测技术。