间充质干细胞治疗缺血性脑卒中的研究进展

周莉，白雪 综述，杨琴 审校

重庆医科大学附属第一医院神经内科，重庆400016

缺血性脑卒中是危害极大的常见神经系统疾病。及早恢复血流灌注是其治疗的关键。但目前公认有效的溶栓、机械取栓等治疗方法，由于治疗时间窗窄，治疗并发症严重，仅能使5%的患者受益，仍需进一步寻找安全有效的治疗方法。

干细胞是一种原始、未分化的细胞，可通过有丝分裂和分化发展成为多种特化细胞，具有再生多种组织和器官的潜力。干细胞的出现以及干细胞移植技术的发展，为缺血性脑卒中的治疗提供了一条新的途径。各种类型的干细胞已在动物模型或临床研究中得到研究，其中，胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）治疗面临伦理问题；神经祖细胞（neuralprogenitor cells，NPCs）难以获取，增殖率低；工程细胞如诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）、人神经干细胞（NT2N／hNT）、CTX0E3、SB623等受到技术阻碍［1］。而间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）因其可用性高，易于分离培养，免疫耐受性高，治疗并发症少，不违背社会伦理等特点，已成为治疗缺血性脑卒中的首选细胞。本文对MSCs的生物学特性及其在缺血性脑卒中治疗中的神经保护机制研究进展作一综述，以期为缺血性脑卒中的治疗提供新的方向。

1 MSCs概述

MSCs最早由FRIEDENSTEIN于1970年首次描述为黏附于塑料上的梭形骨髓基质细胞。1991年，CAPLAN［2］创造了“间充质干细胞”一词，并预测这些中胚层来源的细胞将成为用于再生目的的自体治疗的优选方法。经最近几十年的发展，MSCs已成为研究最广泛的干细胞群，并广泛应用于临床试验和／或治疗各种疾病，包括血液疾病、移植物抗宿主病、自身免疫性疾病，甚至病情严重的新型冠状病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）患者也值得尝试［3］。

MSCs来源广泛，包括骨髓、胎盘、输卵管、脂肪组织、牙髓、唾液腺、下鼻甲、人类母乳等。它们具有附壁性，并可表达间充质标记，包括CD90、CD105、CD73等，但不表达CD11b、CD14、CD19、CD34、CD45和人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）-DR。不同来源的MSCs其表面标记物、特点和分离数量受不同供体特征的限制，如脂肪组织MSCs（adipose tissue-MSCs，ADMSCs）能表达CD49d，并能比骨髓来源MSCs（bone-MSCs，BMSCs）产生更多的肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），且1 g脂肪组织所获得的细胞数量可能是相同重量骨髓的500倍，但ADMSCs可促进已有癌细胞的增殖，尤其是乳腺癌［4］。

MSCs具有自我更新和多态分化的能力，在一定条件下可分化为中胚层（脂肪、骨和软骨）、内胚层（平滑肌）和外胚层（神经元）细胞，从而促进对各种受损组织的修复。神经新生、血管新生和突触可塑性对脑卒中后功能恢复至关重要，由于MSCs具有可塑性、多向分化、免疫调节和抗炎以及神经血管发生等特点，具有参与脑再生的潜力，可促进缺血性脑卒中后的组织修复。

2 MSCs移植治疗缺血性脑卒中的动物实验研究

自1998年AZIZI等［5］发表了第一篇关于人BMSCs移植入大鼠脑的报道以来，MSCs移植治疗神经系统疾病的研究越来越多。在缺血模型的临床前研究中，研究人员通过立体定向移植、血管内移植、鼻内移植等多种途径将MSCs移植入脑内。

2.1 立体定位移植技术 首先，研究者关注的是立体定位移植技术，也称为颅内技术，该技术将MSCs精确地移植至颅内选定的位置，不经过全身代谢周期，更多的MSCs可到达脑损伤的靶部位，是最早用于实验的移植手段。ZHAO等［6］率先进行的BMSCs颅内移植研究显示，BMSCs向脑梗死区迁移，并能在宿主脑内存活并分化为成熟神经元和胶质细胞，促进功能的恢复。在一项类似的研究中，大脑中动脉梗塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）后，通过2次注射将人类脐带MSCs（human umbilical cord-MSCs，HUMSCs）移植至大鼠的脑梗死皮层中，增强了神经元的代谢活性，促进了脑梗死皮层的修复，刺激了脑梗死皮层中的血管生成，改善了大鼠缺血性脑卒中后的功能［7］。此外，BMSCs的脑内移植可调节与脑缺血相关的免疫反应。产生的转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGFβ）等因子抑制了单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）的分泌，限制了CD68+细胞向受损组织浸润。AMINI等［8］将人脂肪来源干细胞（human adipose tissue-derived stem cells，hADSCs）注射至蛛网膜下腔中，也证明了hADSCs的安全性及改善卒中后功能恢复的能力。这些研究促进了MSCs在小鼠缺血性脑卒中模型中的应用。但由于立体定位手术的侵入性和复杂性较高，对大多数临床患者来说应用较为困难，可能导致创伤性或插入性脑水肿，甚至空气栓塞，因此，需优化该移植技术。

2.2 血管内移植 由于立体定位移植技术的侵袭性和复杂性，研究人员发现［9-10］，血管内移植技术，包括静脉（intra-vein，IV移植）、动脉（intra-arterial，IA移植），可使MSCs迁移至破坏区域，促进神经发生和血管形成及轴突的芽生和再髓鞘化，也可减轻小胶质细胞／巨噬细胞对缺血脑组织的浸润，并在脑缺血区发挥抗胶质增生、抗凋亡、促增殖的作用，显著改善脑卒中大鼠的行为表现。IV简单安全，可行性高，可重复操作，患者易接受，不良反应小。此外，这种路径移植的MSCs将优先迁移至脾脏，消除系统性炎症引起的继发性细胞死亡。但IV后的“首过效应”使移植的MSCs分布在肝、肺、脾、肾、骨髓、胸腺，甚至皮肤和肿瘤中，只有少数的MSCs到达病变位置［11］，因此，这种方法需要大量的细胞植入患者体内，可能会增加潜在的副作用和治疗成本。随着基于脑卒中后导管干预治疗（如机械取栓和对缺血半暗带的导管介导溶栓）的不断增加，可能IA在特定情况下是理想的，尤其是大动脉闭塞性脑卒中。IA移植率高，不经其他器官直接快速到达脑皮层及病变外围，能较快地改善动物神经功能［12］。但IA可能形成微栓子而引起新的梗死，通过低剂量动脉内细胞给药可预防栓塞并发症，并诱导功能恢复，但最佳剂量和效果尚需进一步探索。

2.3 其他移植方式 此外，鼻内移植作为一种简单、方便、无创的移植方法，能绕过血脑屏障（blood-brain barrier，BBB），在给药后30 min内到达脑额部，3 h后分布于全脑。WEI等［13］首次提供了鼻内细胞给药治疗缺血性脑卒中的信息，缺氧的BMSCs通过上调一些迁移相关蛋白，包括基质金属蛋白酶-2（matrix metalloprotease-2，MMP-2）、MMP-9和基质细胞衍生因子-1（stromal derived factor-1，SDF-1）受体CXCR4的表达水平，增加BMSCs向缺血区域的归巢，降低缺血性脑卒中后细胞死亡和脑梗死体积。此外，脑卒中后鼻内BMSCs移植可显著减少BBB破坏，促进血管新生、神经新生和神经血管修复，改善局部脑缺血皮质血流量，促进脑功能恢复，有效降低长期的功能损害［14］。这些均证明了该方法的可行性和有效性，是一种有效的微创给药方式。

除此之外，研究还表明，对MSCs进行预处理，如缺氧、可溶性因子转导等可提高MSCs的治疗效果。目前，由于EVs（活细胞释放的一组直径30～300 nm的膜性结构）体积小，且能跨越血脑屏障，无血管阻塞的风险，常用于脑卒中模型的系统移植。应用MSC-EVs后，可观察到对周围免疫反应的长期神经保护和调节，减少脑损伤，恢复缺血后受损的神经功能［15］。其可能是一种很有前前景的治疗方法，但其回避了细胞替代的想法，而且缺乏标准的操作程序。在进行人体试验前，需在未来的动物模型研究中对基于MSC-EVs的治疗方法的有效性和安全性进行批判性评估。

3 MSCs移植治疗缺血性脑卒中的临床研究

临床前证据的不断积累促进了MSCs移植治疗的临床进展，并取得了一定的治疗效果。神经系统疾病的临床治疗可追溯至2002年［16］，当异体BMSCs应用于曾接受过造血干细胞（hematopoietic stem cells，HSCs）治疗的异染性脑白质营养不良（metachromatic leukodystrophy，MLD）患者时，6例MLD患者中有4例改善了神经系统功能，且无论剂量大小，均无任何重大副作用。此后，MSCs在神经系统疾病中的临床应用越来越广泛，目前，研究者采用了多种方法（IV、经动脉导管移植、鞘内注射）将MSCs应用于缺血性脑卒中患者，并重点关注MSCs治疗缺血性脑卒中的安全性、可行性和短期疗效。

2005年，BANG等［17］进行了第一次随机对照临床试验，以评估IV自体BMSCs对大脑中动脉梗死患者的影响。30名30～75岁受试者（BMSCs组5名，对照组25名）在卒中后7 d内随机静脉注入1×108个BMSCs，与安慰剂相比，随访1年未报告任何与移植相关的不良事件，提示IV自体BMSCs对于严重脑梗死患者可能是一种可行的、安全的治疗方法，可改善功能恢复。2010年，LEE等［18］对52例30～75岁的脑梗死患者进行了病例对照研究（BMSCs组16例，对照组36例），IV（分2次）自体BMSCs 5×107个并随访5年，结果表明，患者的死亡率明显低于对照组，且无明显副作用或其他新的并发症，提示了其安全性和有效性，但作者也提出，这取决于患者的具体特征，如血浆SDF-1a水平和侧脑室室下区域受累程度。2013年，孙世超等［19］在35例中风后遗症患者中（MSCs组20例，对照组15例）IV自体100 mL BMSCs混悬液，随访3个月，治疗组中观察到了感觉、运动功能方面的改善，对照组无明显改善。一项单中心、开放标签的RCT研究纳入了31例年龄在18～70岁的中重度（NIHSS≥10分）缺血性颈动脉卒中后不到2周的患者，随机2∶1的患者接受静脉（1～3）×108个BMSCs（n=20）或不接受（n=11），并随访2年，发现静脉移植MSCs治疗中度到重度中风是安全、可行的［20］。这些报道显示，临床输注MSCs治疗脑卒中是安全有效的。

2012年，JIANG等［21］首次经动脉导管移植2×107个UCMSCs至大脑中动脉梗死或出血的周围区域（3例脑梗死，1例脑出血），随访6个月，发现3例脑梗死患者中有2例肌力改善，且未观察到不良事件。

2013年，王利平等［22］报道了160例脑梗死患者经蛛网膜下腔移植160～200 mL自体BMSCs，移植后NIHSS评分较前降低0～8分，生活功能评分较前提高0～15分，且未观察到其他不良反应。2018年，DENG等［23］纳入了108例发病30～90 d的严重脑梗死（NIHSS评分15～25分）患者，随机分为实验组（n=59）和对照组（n=59），每周4次鞘内注射异体BMSCs（1×106个／kg），所有患者在细胞输注前及输注后每隔1年进行1次详细的功能评估和磁共振成像，评估其安全性和有效性，目前正在进行Ⅱ期实验。

现有的临床研究结果为MSCs治疗的安全性和可行性提供了依据，但考虑到患者群体、细胞来源、给药时间和给药方式的差异，以及小样本、缺乏随机化和双盲对照限制了这些结果的解释，因此，MSCs移植治疗对脑卒中患者的安全性和有效性仍存在一些不确定性，需要更高质量的随机临床试验，以为阐明安全性和疗效性提供更可靠的依据。

4 MSCs移植治疗缺血性脑卒中的机制

MSCs具有多种修复受损脑组织的机制，但其具体的修复作用尚未完全阐明。目前，MSCs移植治疗缺血性脑卒中的一般机制主要包括细胞替代、神经回路的重建、血管生成、分泌神经营养因子、免疫调节、促进细胞存活。但这些机制不是单一的过程，而是相互重叠，共同作用促进缺血脑组织修复。

4.1 细胞替代，重建神经回路 体内外研究均表明，MSCs具有多能性，可分化为内、中、外胚层系细胞，包括神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞、内皮细胞和血管平滑肌细胞等。这些成熟的细胞能够融合并替代受损细胞、构成神经血管单元，维持中枢神经系统微环境的稳态，并最终减少脑卒中后的神经功能缺陷。在大鼠缺血1周后，将纯化的人BMSCs移植至脑梗死周围皮层，可显著改善脑功能，且移植的人BMSCs表达星形胶质细胞、少突胶质细胞和神经元的标记物，并建立移植物和宿主轴突之间的连接。其次，在成人侧脑室的室下区和海马齿状回的粒下区含有神经前体细胞，脑缺血后，这些神经前体细胞可从神经源生态位迁移至损伤区域，但因细胞数量太少，不足以对卒中后的功能恢复产生显著影响。MSCs能保护内源性神经前体细胞免受损伤，促进其增殖、迁移和分化，减轻脑组织损伤。MSCs移植至MCAO大鼠后，可观察到病灶区神经前体细胞阳性细胞逐渐增加，同时增加了缺血半球的少突胶质细胞前体细胞数量，促进再髓鞘化和轴突芽生［24］。因此，移植的细胞可分化为功能性细胞，用于卒中的替代治疗，介导梗死区和梗死周围区的神经回路重建，促进神经功能的恢复。

4.2 分泌神经营养因子MSCs可通过产生和分泌神经营养因子，包括脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）、胶质细胞源性神经营养因子（glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF）、HGF、VEGF、血管生成素-1（angiotensin-1，Ang-1）、人胰岛素-生长因子-1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）、表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）及碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）等，通过多种途径协同或平行地直接或间接促进缺血性脑组织的修复和恢复。如BDNF可参与抑制兴奋性毒性、减少神经元凋亡、保护神经元线粒体功能、增强突触活性和内源性神经发生［25］；VEGF可促进星形胶质细胞向成熟神经元的转分化，刺激血管内皮细胞的迁移和增殖，重建血管，改善长距离轴突可塑性，降低MMP-9活性，抑制细胞凋亡，最终改善神经功能［26］；GDNF则有助于促进血管生成和神经发生，减少脑水肿，抑制细胞自噬和凋亡，减少梗死体积和修复学习记忆功能［27］。这些众多的生物效应分子将为MSCs通过多种途径在神经保护方面的作用提供有价值的认识，如抗炎、抗凋亡、抑制纤维化、促进血管生成及神经保护和发生、免疫调节等功能。

4.3 血管生成 血管形成或血管化在介导卒中后梗死区和周围半暗带神经元的存活和再生中发挥关键作用。MSCs可通过分泌促血管生成因子，分化为内皮细胞和／或血管平滑肌细胞，并作为血管周细胞参与侧支重构。

首先，MSCs分泌可溶性血管生成因子，这是其在新生血管形成中发挥作用的主要机制。此外，各种可溶性生长因子和蛋白质可放大它们的血管生成和动脉生成潜能。血管生成因子包括直接（VEGF、bFGF、HGF、Ang-1）和间接（TGF-β、IL-3、IL-6、IL-8）促血管生成因子，如缺血小鼠脑内移植VEGF-MSCs可增加微血管密度，增强MSCs存活，改善行为功能［26］；Ang-1参与血管的成熟、稳定和重构，可促进大脑血管新生，防止血管系统中泄漏，该作用有助于脑缺血后的抗水肿作用；与hMSC或Ang-hMSCs相比，Ang-VEGF-hMSCs对病变体积的影响更大，可促进局部小块新生血管形成，使新生血管形成最大，功能恢复；IL-6增加ECs的存活，IL-3刺激VEGF基因表达及SMCs迁移和增殖［28］。其次，MSCs也表现出内皮细胞和血管平滑肌细胞分化的趋势，并表达相关细胞标志物，同时保护内皮细胞和内皮祖细胞免受损伤，促进卒中后血管生成［29］。同时，移植的MSCs与血管周围的周细胞有许多相似之处，常阻滞在血管区域，以类似周细胞的方式稳定血管形成，这些作用共同促进了MSCs移植对卒中后血管重建的作用，从而改善缺血性脑卒中的功能预后。

4.4 免疫调节 体内、外研究表明，MSCs可通过与先天性和适应性的免疫细胞相互作用，同时调节系统免疫反应，帮助修复受损脑组织。MSCs可抑制M1型小胶质细胞／巨噬细胞的激活，减少促炎细胞因子，如肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、IL-1、促氧化酶和趋化因子的释放，促进保护性M2型小胶质细胞／巨噬细胞分化，减少中性粒细胞的过度浸润，抑制自然杀伤（natural killer cell，NK）细胞的细胞毒性，抑制CD14+单核细胞和CD34+祖细胞向树突状细胞（dendritic cells，DCs）的分化和成熟，并使成熟的DCs向未成熟状态倾斜，促进调节性T细胞（regulatory T cells，Tregs）的分化和增殖，抑制CD8+T细胞介导的靶细胞裂解，调节B细胞增殖、趋化作用和免疫球蛋白（IgM、IgG和IgA）的产生［30］。同时，MSCs可降低外周免疫抑制，减弱炎症反应，降低全身感染的发生率，并可能形成先天免疫类记忆反应，从而对急性炎症提供长期的持续保护［31］。利用其免疫调节作用可能有助于减少脑缺血后脑组织损伤和促进脑修复，但仍需大量临床前和临床试验进一步证实。

4.5 促进细胞的存活 缺血性脑卒中会诱导细胞的自噬、凋亡、坏死，有研究表明，MSCs可调节缺血性脑卒中后细胞死亡，促进细胞存活，减少神经功能损伤。

首先，MSCs的移植能够通过早期（缺血后24 h内）增加自噬，晚期（缺血后48～72 h）抑制自噬，促进受损细胞的存活。在卒中后早期，MSCs通过分泌BDNF，减少mTOR通路的激活，促进自噬标志物Beclin-1和微管相关蛋白LC3的表达，增强神经元自噬，抑制神经元凋亡，最终改善脑缺血损伤的恢复［32］。但持续48～72 h或更长时间的缺氧和葡萄糖缺乏会导致过度的自噬，在该时期，MSCs移植可降低Beclin-1和LC3的表达，促进神经突生长和再生，抑制自噬，保护神经元。在MCAO大鼠模型中，尾静脉注射ADMSCs可通过诱导抗凋亡因子Bcl-2的激活，抑制内质网应激和促凋亡分子Bax的活性，从而减少缺血脑组织的凋亡［33］。MSCs还可引起MMPs功能障碍，并阻止其上调，抑制caspase-3等细胞死亡信号，激活STAT3和Akt磷酸化等细胞存活信号通路。最近还发现，MSCs可通过将自身的线粒体转移至神经元中，增加神经元活动和改善代谢功能，挽救受损神经元［34］。

5 结论

综上所述，动物和临床研究均广泛证实了MSCs移植在治疗缺血性脑卒中的作用，其机制复杂且相互作用。但由于患者病情和生理条件不同，在临床应用前仍有许多关键问题需解决，如最佳细胞来源、剂量、移植时间窗和途径、不良事件监测和处理等。因此，更好地了解MSCs治疗中风的机制，将有助于解决上述问题。总之，MSCs可作为中风治疗的候选新的治疗途径，以改善缺血性脑卒中患者的神经功能、生存和生活质量。