CRISPR⁃Cas9技术在肿瘤耐药基因筛选中的研究进展

张 洁，杨 谭，卢永刚

（广西壮族自治区柳州市柳铁中心医院药剂科，广西柳州545007）

癌症是临床上常见的恶性肿瘤，进展快、死亡率高，给患者身心及经济上带来了巨大损害。肿瘤分子靶向药物的出现将癌症的治疗推向了一个前所未有的阶段。使用肿瘤分子靶向药物治疗肿瘤面临的最主要问题就是耐药，一些分子靶向药物可能同时具有多种耐药机制。靶向药物耐药的主要机制包括微环境的改变、基因突变、建立代偿信号通路、存在肿瘤异质性以及肿瘤对靶向药产生耐受性等。近年来，高通量功能性筛选技术为肿瘤研究提供了精准的基因学信息。而CRISPR⁃Cas9文库筛选技术是一种精准、简便、高效的基因编辑工具，为肿瘤相关耐药基因的功能学研究提供了新方法、新思路［1］。本文总结了CRISPR⁃Cas9文库筛选技术在肿瘤耐药基因筛选中的研究进展。

1 耐药基因筛选的现状

筛选耐药基因当前常用策略主要分为两种，即功能缺失型筛选及功能获得型筛选。RNA干扰（RNA interference，RNAi）在真核细胞中广泛存在，已广泛应用于功能性缺失基因的高通量筛选［2］。与cDNA文库相比，RNAi文库筛选虽具有简单、高效、高通量的优点，但仍存在一些问题［3］。无论是使用cDNA文库还是RNAi文库进行耐药基因筛选都不够精准。因此，寻找新的筛选工具对肿瘤耐药基因的发现及研究有着重要的意义。

2 CRISPR‑Cas9的生物学特性

CRISPR⁃Cas是细菌和古细菌在长期演化过程中为了对抗入侵的病毒及外源DNA进化形成的一种适应性免疫防御［4］。CRISPR⁃Cas于1987年被首次发现，其强大的剪切编辑功能在2010年被研究清楚，从而被广泛应用于生物学研究［5］。CRISPR/Cas9系统能识别出入侵者的原间隔序列并记录到CRISPR序列中。当剪切基因时，crRNA首先被转录成pre⁃crRNA。特异性RNA核酸酶和活化的cas9对pre⁃crRNA进行加工［6］。CRISPR⁃Cas9系统通过与目标序列互补配对，引导Cas9定位于目标基因，在PAM上游约3 bp处进行DNA双链切割［7］。当没有修复模板时，将通过非同源末端连接将DS⁃Bs重新连接，这样容易产生插入或突变缺失，导致基因功能丧失［6］。

CRISPR⁃Cas9技术可以根据不同实验的需要进行更加精细的调整［7］。全基因组的CRISPR筛选几乎可以应用于任何细胞系和遗传背景下的基因筛选，如KRAS、EGFR、ALK突变或其他人类肿瘤细胞系。其他递送方法，如原位移植或静脉注射，有助于鉴别那些参与肿瘤血管形成和外渗的过程［8］。

近年来，CRISP⁃Cas9系统已经成功应用于人类、小鼠、鱼、果蝇、酵母、烟草、番茄、水稻、大豆、玉米、小麦等多个物种细胞的基因编辑，科学家们利用CRISPR⁃Cas9技术开始进行功能性的基因筛选。CRISPR⁃Cas9技术在基因编辑中具有一定优越性，可采用诱导基因突变方式进行功能缺失型筛选，更加高效、精准；敲除效率高，具有更广泛的作用位点及较低的脱靶效率。CRISPR⁃Cas9基因敲除可用于大部分的基因修饰研究，而且操作相对简单，可以在普通实验室进行，将会在定向编辑研究中带来突破性的发展［9］。

3 CRISPR‑Cas9在肿瘤耐药中的应用

3.1 CRISPR‑Cas9在肝癌耐药中的应用进展

通过全基因组CRISPR⁃Cas9文库筛选，研究者已经筛选出在肝癌发生、发展中的抑癌基因AD⁃AMTSL3、PTEN［10］，以 及 促 癌 基 因NSD1、NCAPG［11，12］，这 证 明 了CRISPR⁃Cas9文 库 筛 选 在肝癌耐药基因筛选中的可行性。索拉非尼是晚期肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的标准治疗方法，然而肿瘤细胞可表现出对索拉非尼的原发性或继发性耐药。Wei等［13］通过使用全基因组CRISPR⁃Cas9文库筛选，发现磷酸甘油酸脱氢酶（phosphoglycerate dehydrogenase，PHGDH）是索拉非尼耐药的关键驱动因素。索拉非尼治疗后PHG⁃DH失活会升高活性氧（reactive oxygen species ROS）水平并诱导HCC凋亡。PHGDH抑制剂NCT⁃503的治疗与索拉非尼有协同作用，可消除体内HCC的生长，因此，靶向PHGDH是克服HCC耐药性的有效方法。使用同样的方法，Cai等［14］在人类Huh7细胞中发现LRP8是驱动HCC细胞获得索拉非尼耐药的关键基因，LRP8通过激活β⁃catenin，增强了其对索拉非尼的耐药性。Zheng等［15］通过基于模型的全基因组CRISP/Cas9敲除（MAGeCK）分析，KEAP1被确定索拉非尼耐药性和/或HCC细胞敏感性相关的非突变机制的必需基因。KEAP1失活后，KEAP1/Nrf2通路的失控通过上调Nrf2下游基因和降低ROS水平导致治疗HCC的索拉非尼、乐伐替尼和雷戈非尼耐药。此外，通过该方法还筛选出对索拉非尼耐药的关键基因SGOL1［16］。

3.2 CRISPR‑Cas9在肺癌耐药中的应用进展

化学疗法作为单独或与手术和放疗结合使用的全身疗法，旨在阻止癌细胞的增殖、侵袭和转移，并最终诱导癌细胞死亡。目前，癌细胞的耐药性已成为影响化疗疗效的主要原因。编辑耐药基因可提高化疗疗效和疗效。目前，CRISPR⁃Cas9已被用于研究与肺癌药物敏感性和耐药性有关的基因，如顺铂、卡铂和紫杉醇等，为提高化疗对肺癌的治疗效果提供了理论基础。在H460和H1299细胞中，将RSF1基因与紫杉醇联合敲除会导致G1的细胞周期停滞，同时抑制细胞迁移和增殖；在使用H 460细胞的异种移植小鼠肺癌模型中，与野生型相比，敲除RSF1显着提高了对紫杉醇的敏感性，降低了移植肿瘤的重量（P<0.01）和体积（P<0.05）［17］。在另一项使用肺癌异种移植小鼠模型的研究中，CRIS⁃PR⁃Cas9在A 549细胞中敲除了NRF2基因，发现相对于野生型动物，肿瘤细胞对顺铂和卡铂敏感，移植瘤的体积明显降低［18］。在NSCLC细胞系中，CRISPR⁃Cas9敲除极光B（AURKB）导致肿瘤的恢复，抑癌基因TP53的表达，恢复了对顺铂和紫杉醇的敏感性［19］。另一项研究表明，CRISPR⁃Cas9敲除ERCC1会使癌细胞对顺铂高度敏感［20］。肺癌对化疗药物耐药性的研究为提高药物敏感性和降低或消除肺癌对化疗药物的耐药性提供了科学依据。

3.3 CRISPR‑Cas9在乳腺癌耐药中的进展

雌激素受体（estrogen receptor，ER）和人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor recep⁃tor 2 HER2）突变在乳腺癌治疗耐药中作用关键，CRISPR⁃Cas9系统可用于靶向乳腺癌患者的ER或HER2突变体。sgRNA被设计为靶向ER或HER2突变外显子中的特定序列，以修复突变，消除致癌突变。同时，CRISPR⁃Cas9还可以破坏ER或HER2的特定功能域，使癌细胞失去了获得性耐药性［21，22］。使 用CRISPR⁃Cas9技 术 使 得 两 种 三 阴 性乳腺癌（triple⁃negative breast cancer，TNBC）细胞系MDA⁃MB⁃231（野生型）和MDA⁃MB⁃436（BRCA 1 m）产生缺陷，可使TNBC细胞对3种代表性的化学治疗乳腺癌药物阿霉素、吉西他滨和多西他赛更加敏感［23］。使用同样的细胞系，使用CRISPR⁃Cas9进行CXCR4或CXCR7基因的单敲除后，可显著抑制TNBC细胞的恶性进展，用于乳腺癌治疗耐药靶标［24］。总之，CRISPR⁃Cas9系统可恢复耐药基因突变并确定耐药性乳腺癌的潜在耐药靶标。CRIS⁃PR⁃Cas9系统有望在预防乳腺癌治疗耐药中发挥重要作用，成为个性化医学的重要工具［25］。

3.4 CRISPR‑Cas9在其它疾病耐药中的应用

CRISPR⁃Cas9文库早期经常应用于药物作用基因筛选。Shalem等［26］设计了CRISPR⁃Cas9基因敲除文库，并命名为GeCKO（Genome⁃scale CRIS⁃PR⁃Cas9 knockout）文 库。加 入vemurafenib抑 制A 375细胞的生长，进而富集少数具有vemurafenib抗性的细胞，其中nf2、cul3、tada2b和tada1与vemu⁃rafenib抗性无关。这些候选基因为vemurafenib肿瘤的耐药机制提供了新的假说。研究者还证明了CRISPR⁃Cas9用 于 耐 药 基 因 筛 选 的 可 靠 性［27］。Zhou等［28］设计了一个针对这291个靶向基因，除已知的炭疽受体Antxr1外含有869条sgRNA基因的慢病毒聚焦人力资源库。这种聚焦文库减少了筛选范围、实验成本及操作难度。选择合适的库容量可以更有效地筛选库，提高实验成功率。

4 展望

CRISPR⁃Cas9基因组编辑技术是二十一世纪的一项重大的科学突破，推动了生命科学相关领域的研究，对基础科研领域产生了革命性的影响，在未来，CRIS⁃PR⁃Cas9技术的应用也必将越来越广泛。自2014年以来，利用该技术研究人员在药物靶标发现、基因功能研究、药物敏感基因研究、病毒宿主研究等领域取得了巨大的成功。基于CRISPR⁃Cas9的高通量功能性筛选技术将成为功能基因研究的首选工具。