洋金花中生物碱成分的研究

王玉伟 ，赫 军，王晓燕 ，甘 禾 ，张维库*，续洁琨

1.北京中医药大学生命科学学院&中药学院，北京 100029

2.中日友好医院 临床医学研究所&药学部，北京 100029

洋金花Daturae Flos为茄科（Solanaceae）曼陀罗属DaturaL.植物白花曼陀罗Datura metelL.的干燥花，又名闹洋花、凤茄花、风茄花、曼陀罗花等，主要分布在我国的江苏、福建、广东、海南等地[1]。其花入药，具有平喘止咳、解痉定痛之功效；临床用于哮喘咳嗽、脘腹冷痛、风湿痹痛、小儿慢惊、外科麻醉[2]。现代药理学研究表明洋金花生物活性广泛，主要表现为对呼吸系统和神经系统的影响，以及抗肿瘤、抗菌和抗炎活性等[3-4]。目前从洋金花中分离鉴定的化合物主要为生物碱类、醉茄内酯类、黄酮类和木脂素类等，其中，生物碱成分是洋金花中最主要的化合物之一，最大含量可达0.43%[5]，代表性的化合物为阿托品和东莨菪碱等。然而多年来，洋金花中的生物碱类化合物报道很少，化学和药理研究的深度也远远不够，为了更好地阐明洋金花的药效物质以及从洋金花中发现活性显著的先导化合物，本课题组在前期的研究基础上[6-7]对洋金花干燥花的化学成分进行了进一步的分离和纯化，通过多种色谱和波谱方法，从中分离鉴定了13个生物碱类化合物，分别为3-hydroxy-1-(4-hydroxy-phenethyl) pyrrolidine-2,5-dione（1），L-焦谷氨酸甲酯（L-pyroglutamic acid methyl ester，2）、喹啉（quinoline，3）、烟酸（nicotinic acid，4）、1H-咪唑-4-羧酸丁酯（butyl 1H-imidazole-4-carboxylate，5）、苯基-β-萘胺（phenyl-β-naphthylamine，6）、4-(羟甲基)-3-(4-羟基苯乙基)吡啶-2(1H)-酮（aristopyridinone A，7）、半枝莲碱（scutebarbatine A，8）、金色酰胺醇酯（aurantiamide acetate，9）、对羟基苯乙胺（tyramine，10）、苯乙胺（henethylamine，11）、苯丙氨醇（phenyl-alalninol，12）、尿苷（uridine，13）。其中，化合物1～9、11和12为首次从曼陀罗属植物中分离得到；化合物10和13为首次从该植物中分离得到。

1 仪器和材料

Bruker AV-400/500/600型核磁共振仪（Bruker Biospin公司）；Q-Exactive Orbitrap型液相色谱-质谱联用仪（液相系统，Waters公司；质谱系统，Thermo公司）；分析高效液相色谱仪（Agilent 1260型，DAD检测器，Agilent公司）；制备高效液相色谱仪（泵LC-20A，检测器SPD-20 A，岛津公司）；ZF-I型三用紫外分析仪（上海舒源分析仪器厂）；CP225D型十万分之一电子分析天平（赛多利斯公司）；EYELA旋转蒸发仪（东京理化公司）；硅胶薄层板（烟台化学工业研究所）；柱色谱硅胶（100～200、200～300目，青岛海洋化工厂）；ODS（30～50 μm，YMC公司）；Sephadex LH-20型凝胶（Pharmacia公司）；Phenomenex Synergi C18分析型液相色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Phenomenex Luna C18制备型液相色谱柱（250 mm×10 mm，5 μm），Phenomenex公司；所有试剂均为分析纯（北京化工厂）和色谱纯（Honeywell公司）。

本课题所用药材与2016年7月采收自广东省清远市，由中日友好医院马秉智副主任药师鉴定为茄科曼陀罗属植物白花曼陀罗D.metelL.的干燥花，样本（20160726）存放于中日友好医院临床医学研究所。

2 提取与分离

洋金花（62.0 kg）以95%（500 L）和70%（500 L）的乙醇分别回流提取3次，每次2 h，合并提取液，减压浓缩得到总浸膏（约2 kg）。总浸膏加水稀释混悬后分别经石油醚、二氯甲烷和醋酸乙酯萃取各3次，减压浓缩，依次得石油醚萃取物、二氯甲烷萃取物、醋酸乙酯萃取物和水层部分。二氯甲烷萃取物（578 g）经硅胶柱（15 cm×120 cm）进行洗脱，二氯甲烷-甲醇（100∶0→1∶1），得到组分Fr.A～H。

Fr.C（112 g）硅胶柱色谱分离，二氯甲烷-甲醇（100∶0→90∶10）洗脱，得到4个流分（Fr.C1～C4）。Fr.C1经过ODS柱色谱分离（甲醇-水3∶7→1∶0）得到13个流分（Fr.C1.1～C1.13）。Fr.C1.11经制备高效液相色谱仪分离（甲醇-水70∶30，体积流量5 mL/min）得到化合物9（5 mg，tR＝27.2 min）。Fr.C3经过ODS柱色谱分离（甲醇-水3∶7→1∶0）得到18个流分（Fr.C3.1～C3.18）。取Fr.C3.5经制备高效液相色谱仪分离（甲醇-水40∶60，体积流量5 mL/min），再用流动相（乙腈-水30∶70，体积流量5 mL/min）纯化，得到化合物7（33 mg，tR＝30.2 min）。取Fr.C3.17经制备高效液相色谱仪分离（乙腈-水 45∶55，体积流量5 mL/min），分离得到化合物8（5 mg，tR＝24.7 min）。Fr.G（20 g）硅胶柱色谱分离（二氯甲烷-甲醇10∶0→9∶1）洗脱，得到8个流分（Fr.G1～G4）。Fr.G2经过ODS柱色谱分离（甲醇-水1∶9→1∶0）得到14个流分（Fr.G2.1～G2.14），Fr.G2.1经制备高效液相色谱仪分离（甲醇-水25∶75，体积流量10 mL/min）得到化合物2（5 mg，tR＝25.5 min）。Fr.G2.3经制备高效液相色谱仪分离（甲醇-水20∶80，体积流量8 mL/min）得到化合物13（5 mg，tR＝29.4 min）。

醋酸乙酯萃取部位（720 g）经硅胶柱色谱分离，二氯甲烷-甲醇（100∶0→1∶1）洗脱，流分经薄层色谱检测，得到9个组分（Fr.A～I）。

Fr.A（10 g）经硅胶柱色谱分离（石油醚-醋酸乙酯100∶0→0∶100）洗脱，得到12个组分（Fr.A.1～A.12）。取Fr.A.4经制备高效液相色谱仪（甲醇-水90∶10，体积流量5 mL/min）得化合物6（30 mg，tR＝40.2 min）。取Fr.A.7过Sephadex LH-20型凝胶（甲醇-水，1∶1）洗脱，得到4个流分（Fr.A.7-1～A.7.4）。Fr.A.7.3经制备高效液相色谱仪（甲醇-水85∶15，体积流量5 mL/min）分离得化合物5（5 mg，tR＝38.7 min）。Fr.E经硅胶柱色谱（二氯甲烷-甲醇 100∶0→0∶100）洗脱，流分经薄层色谱检测，得到9个组分（Fr.E.1～E.9）。Fr.E.2经过ODS反向柱色谱分离（甲醇-水10∶90→100∶0）洗脱得到3个流分（Fr.E.2.1～E.2.3）。Fr.E.2.2经制备高效液相色谱仪（甲醇-水45∶55，4 mL/min）得化合物4（5 mg，tR＝36.6 min）。Fr.E.5经过ODS反向柱色谱分离（甲醇-水10∶90→100∶0）洗脱得到10个流分（Fr.E.5.1～E.5.10）。Fr.E.5.7经过ODS反向柱色谱（甲醇-水10∶90→100∶0）洗脱得到5个流分（Fr.E.5.7.1～E.5.7.5）。Fr.5.7.3经制备高效液相色谱仪（甲醇-水40∶60，体积流量4 mL/min）得化合物3（6 mg，tR＝46.8 min）。Fr.E.5.7.4经ODS反向柱色谱分离（甲醇-水1∶9→1∶0）洗脱得到6个流分（Fr.E.5.7.4.1～E.5.7.4.6）。Fr.E.5.7.4.3经制备高效液相色谱仪（甲醇-水25∶75，体积流量5 mL/min）得化合物12（8 mg，tR＝25.3 min）。Fr.E.5.7.4.5经Sephadex LH-20型凝胶（甲醇-水1∶1）纯化，再经制备高效液相色谱仪（甲醇-水28∶72，体积流量5 mL/min）得化合物11（6 mg，tR＝23.7 min）。Fr.F经硅胶柱色谱分离（二氯甲烷-甲醇100∶0→1∶1）洗脱得到6个组分（Fr.F.1～F.6）。Fr.F.4经Sephadex LH-20凝胶色谱（甲醇-水1∶9→1∶0）洗脱得到7个组分（Fr.F.4.1～F.4.7）。Fr.F.4.5过Sephadex LH-20型凝胶（甲醇-水1∶9→1∶0）洗脱，得到4个流分（Fr.F.4.5.1～F.4.5.4），Fr.F.4.5.2经制备高效液相色谱仪（甲醇-水-30∶70，含0.1%三氟乙酸，体积流量5 mL/min）得化合物1（4 mg，tR＝40.3 min）。Fr.G经硅胶柱色谱分离（二氯甲烷-甲醇9∶1→0∶1）洗脱，得到5个组分（Fr.G.1～G.5），Fr.G.5经Sephadex LH-20型凝胶（甲醇-水1∶9→1∶0）洗脱，得到4个流分（Fr.G.5.1～G.5.4），Fr.G.5.4经硅胶柱色谱分离（二氯甲烷-甲醇1∶0→0∶1）洗脱得到5个组分（Fr.G.5.4.1～G.5.4.5）。Fr.G.5.4.4经制备高效液相色谱仪（甲醇-水16∶84，含0.1%三氟乙酸，体积流量5 mL/min）得到化合物10（5 mg，tR＝30.5 min）。

3 结构鉴定

化合物1：黄色油状物。1H-NMR (500 MHz,DMSO-d6)δ: 6.98 (2H, d,J= 5.6 Hz, H-2′, 6′), 6.68(2H, d,J= 5.8 Hz, H-3′, 5′), 3.49 (2H, t,J= 5.7 Hz,H2-3), 2.96 (1H, dd,J= 3.6, 18.1 Hz, H-4a), 2.83 (1H,m, H-6), 2.73 (1H, d,J= 16.7 Hz, H-4b), 2.63 (2H, t,J= 13.5 Hz, H2-7)；13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6)δ: 178.5 (C-5), 174.8 (C-2), 155.9 (C-4′), 129.5 (C-2′,6′), 128.2 (C-1′), 115.3 (C-3′, 5′), 71.6 (C-3), 42.1(C-6), 41.1 (C-4), 32.1 (C-7)。以上数据与文献数据[8]进行对比，鉴定化合物 1为 3-hydroxy-1-(4-hydroxyphenethyl) pyrrolidine-2,5-dione。

化合物2：无色油状物。HR-ESI-MSm/z:144.065 6 [M＋H]+（计算值为144.065 5）。1H-NMR(400 MHz, CD3OD)δ: 4.27 (1H, dd,J= 9.1, 4.6 Hz,H-2), 3.78 (3H, s, 3-CH3), 2.50 (1H, m, H-3a), 2.36(2H, m, H-3b, 4a), 2.19 (1H, m, H-4b)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD)δ: 181.6 (C-5), 174.5 (C-6), 57.0(-OCH3), 52.9 (C-2), 30.5 (C-4), 26.1 (C-3)。以上数据与文献数据[9]进行对比，鉴定化合物2为L-焦谷氨酸甲酯。

化合物3：白色无定形粉末。1H-NMR (500 MHz,DMSO-d6)δ: 8.98 (1H, d,J= 3.9 Hz, H-2), 8.69 (1H,d,J= 8.4 Hz, H-3), 8.15 (1H, d,J= 8.4 Hz, H-9), 8.08(1H, d,J= 8.4 Hz, H-4), 7.82 (1H, d,J= 8.5 Hz, H-6),7.79 (1H, d,J= 8.5 Hz, H-8), 7.67 (1H, t,J= 7.5 Hz,H-5)；13C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz)δ: 150.4 (C-2),148.4 (C-9), 129.5 (C-7), 129.4 (C-8), 127.4 (C-10),126.1 (C-5), 124.7 (C-6), 121.1 (C-3)。以上数据与文献数据[10]进行对比，鉴定化合物3为喹啉。

化合物4：白色无定形粉末。HR-ESI-MSm/z:124.039 1 [M＋H]+（计算值为124.039 3）。1H-NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ: 9.08 (1H, s, H-2), 8.78 (1H,s, H-6), 8.27 (1H, d,J= 7.5 Hz, H-4), 7.54 (1H, m,J=7.0 Hz, H-5)；13C-NMR (125MHz, DMSO-d6)δ:166.3 (C-1), 153.1 (C-2), 150.2 (C-6), 136.9 (C-4),126.9 (C-3), 123.8 (C-5)。以上数据与文献数据[11]进行对比，鉴定化合物4为烟酸。

化合物5：淡黄色油状物。HR-ESI-MSm/z:169.110 2 [M＋H]+（计算值为169.092 2）。1H-NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ: 7.72 (1H, d,J= 4.9 Hz,H-5), 7.67 (1H, d,J= 4.9 Hz, H-2), 4.22 (2H, t,J=6.7 Hz, H2-7), 1.66 (2H, m, H2-8), 1.37 (2H, m, H2-9),0.91 (3H, t,J= 7.4 Hz, H3-10)；13C-NMR (125 MHz,DMSO-d6)δ: 166.9 (C-6), 131.7 (C-4), 131.6 (C-2),128.7 (C-5), 65.0 (C-7), 30.0 (C-8), 18.7 (C-9), 13.6(C-10)。以上数据与文献数据[12]进行对比，鉴定化合物5为1H-咪唑-4-羧酸丁酯。

化合物6：黄色油状物。1H-NMR (500 MHz,DMSO-d6)δ: 8.04 (1H, s, -NH), 7.78 (1H, d,J =9.0 Hz, H-4), 7.75 (1H, d,J =9.0 Hz, H-5), 7.68 (1H, d,J =8.5 Hz, H-8), 7.45 (1H, d,J =2.3 Hz, H-1), 7.37(1H, t,J =15.0 Hz, H-7), 7.30 (2H, d,J =8.5 Hz,H-3′, 5′), 7.27 (1H, d,J =4.5 Hz, H-6), 7.24 (1H, d,J =7.0 Hz, H-3), 7.20 (2H, d,J =8.0 Hz, H-2′, 6′),6.88 (1H, t,J =14.5 Hz, H-4′)；13C-NMR (125 MHz,DMSO-d6)δ: 143.1 (C-1′), 141.4 (C-2), 134.4 (C-8a),129.3 (C-3′, C-5′), 128.9 (C-4), 128.2 (C-4a), 127.5(C-5), 126.4 (C-7), 126.2 (C-8), 122.8 (C-6), 120.3(C-4′), 119.9 (C-3), 117.4 (C-2′, C-6′), 108.9 (C-1)。以上数据与文献数据[13]进行对比，鉴定化合物6为苯基-β-萘胺。

化合物7：白色无定形粉末。HR-ESI-MSm/z:246.111 9 [M＋Na]+（计算值为246.112 5）。1H-NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ: 9.48 (1H, s, 11-NH), 9.22(1H, s, 4-OH), 6.98 (1H, d,J= 3.9 Hz, H-12), 6.93(2H, d,J= 8.4 Hz, H-2, 6), 6.66 (2H, d,J= 8.4 Hz,H-3, 5), 6.16 (1H, d,J= 4.0 Hz, H-13), 5.26 (1H, t,J=5.4 Hz, 15-OH), 4.40 (2H, m, H2-8), 4.28 (2H, d,J=4.9 Hz, H2-15), 2.86 (2H, m, H2-7)；13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6)δ: 179.0 (C-10), 155.9 (C-4), 143.4(C-14), 131.4 (C-9), 129.7 (C-2, 6), 128.5 (C-1), 124.1(C-12), 115.2 (C-3, 5), 109.4 (C-13), 54.7 (C-15), 47.0(C-8), 36.2 (C-7)。以上数据与文献数据[14]进行对比，鉴定化合物7为4-(羟甲基)-3-(4-羟基苯乙基)吡啶-2(1H)-酮。

化合物8：白色无定形粉末。HR-ESI-MSm/z:559.242 4 [M＋H]+（计算值为559.243 9）。1H-NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ: 8.87 (2H, d,J= 2.2 Hz,H-3′, 3″), 8.71 (2H, m, H-5′, 5″), 8.06 (2H, dt,J= 8.0,2.0 Hz, H-7′, 7″), 7.44 (2H, ddd,J= 14.9, 8.0, 4.8 Hz,H-6′, 6″), 6.55 (1H, d,J= 17.0 Hz, H-12), 6.40 (1H, d,J= 17.0 Hz, H-11), 5.80 (1H, d,J= 10.0 Hz, H-6),5.60 (1H, d,J= 10.0 Hz, H-7), 5.21 (1H, s, H-14),5.21 (1H, s, H-3), 5.06 (1H, m, H-16), 2.30 (1H, d,J=12.5 Hz, H-10), 2.02 (1H, s, H-2), 1.63 (1H, m, H-1a),1.40 (1H, m, H-1b), 1.54 (3H, s, H3-18), 1.40 (3H, s,H3-19), 1.20 (3H, s, H3-20), 0.97 (3H, s, H3-17)；13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6)δ: 73.8 (C-15), 164.6(C-1′), 164.3 (C-1″), 163.7 (C-13), 153.8 (C-5″), 153.8(C-5′), 150.2 (C-3′), 149.6 (C-3″), 147.6 (C-11), 140.4(C-4), 136.9 (C-7′), 136.5 (C-7″), 125.4 (C-2′), 124.6(C-2″), 123.8 (C-3), 123.6 (C-6′), 123.2 (C-6″), 121.6(C-12), 113.6 (C-14), 76.2 (C-6), 75.9 (C-8), 75.5(C-7), 70.7 (C-16), 48.4 (C-9), 42.8 (C-5), 42.3 (C-10),25.7 (C-2), 22.5 (C-17), 19.6 (C-18), 18.7 (C-1), 17.0(C-19), 15.1 (C-20)。以上数据与文献数据[15]进行对比，鉴定化合物8为半枝莲碱。

化合物9：白色絮状物。HR-ESI-MSm/z:445.211 2 [M－H]-（计算值为445.212 2）。1H-NMR(500 MHz, CDCl3)δ: 8.51 (1H, d,J= 8.4 Hz, 8-NH),8.14 (1H, d,J= 8.4 Hz, 8′-NH), 7.81～7.75 (2H, m,H-3″, 7″), 7.51 (t,J= 7.3 Hz, H-5″), 7.44 (2H, t,J=7.5 Hz, H-4″, 6″), 7.26～7.31 (8H, m, H-6～8, 5′～9′), 7.15 (3H, m, H-6～8), 4.67 (1H, dt,J= 9.1, 5.1 Hz, H-2′), 4.18 (1H, d,J= 6.8 Hz, H-2), 4.01 (1H, dd,J= 11.0, 4.8 Hz, H-1a), 3.86 (1H, dd,J= 11.0, 6.7 Hz,H-1b), 3.96 (2H, m, H2-3′), 2.78 (2H, m, H2-3), 1.97(3H, s, CH3-CO)；13C-NMR (125 MHz, CDCl3)δ:171.2 (CH3-CO), 170.2 (C-1′), 166.1 (C-1″), 138.3(C-4), 138.0 (C-4′), 134.0 (C-2″), 131.2 (C-5″), 129.1(C-6′, 8′), 128.2 (C-6, 8), 128.0 (C-4″, 6″), 127.4(C-3″, 7″), 126.2 (C-7), 64.6 (C-1), 54.8 (C-2′), 49.1(C-2), 37.2 (C-3′), 36.5 (C-3), 20.6 (CH3-CO)。以上数据与文献数据[16]进行对比，鉴定化合物9为金色酰胺醇酯。

化合物10：白色固体。1H-NMR (500 MHz,DMSO-d6)δ: 7.03 (2H, d,J =8.0 Hz, H-2, 6), 6.72(2H, d,J =8.0 Hz, H-3, 5), 2.96 (2H, dd,J= 10.0, 5.2 Hz, H-8), 2.74 (2H, t,J= 8.0 Hz, H2-7)；13C-NMR(125 MHz, DMSO-d6)δ: 156.3 (C-4), 129.6 (C-2),129.6 (C-6), 127.3 (C-1), 115.5 (C-3), 115.5 (C-5),40.4 (C-8), 32.3 (C-7)。以上数据与文献数据[17]进行对比，鉴定化合物10为对羟基苯乙胺。

化合物11：灰白色粉末。1H-NMR (500 MHz,DMSO-d6)δ: 7.13～7.22 (5H, m, H-2～6), 2.83 (2H,d,J =7.1 Hz, H2-8), 1.23 (2H, s, H2-7)；13C-NMR(125 MHz, DMSO-d6)δ: 140.4 (C-3), 129.4 (C-2),129.4 (C-6), 127.7 (C-3), 127.7 (C-5), 125.4 (C-4),41.4 (C-8), 41.0 (C-7)。以上数据与文献数据[18-19]进行对比，鉴定化合物11为苯乙胺。

化合物12：黄色油状物。1H-NMR (500 MHz,DMSO-d6)δ: 7.20～7.28 (5H, m, H-6～10), 3.83 (1H,dd,J= 9.0, 7.0 Hz, H-3), 3.54 (2H, m, H2-3), 2.80 (2H,d,J =7.2 Hz, H2-4)；13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6)δ:138.9 (C-4), 128.2 (C-5, 9), 128.1 (C-6, 8), 126.4 (C-7),64.0 (C-1), 55.0 (C-2), 41.3 (C-3)。以上数据与文献数据[20]进行对比，鉴定化合物12为苯丙氨醇。

化合物13：白色无定形粉末。HR-ESI-MSm/z:243.062 2 [M－H]-（计算值为243.061 2）。1H-NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 11.30 (1H, s, 3-NH), 7.88 (1H,d,J= 8.1 Hz, H-6), 5.77 (1H, d,J= 5.4 Hz, H-1′), 5.64(1H, d,J= 7.8 Hz, H-5), 4.02 (1H, m, H-2′), 3.97 (1H,m, H-3′), 3.85 (1H, m, H-4′), 3.61～3.56 (2H, m, H2-5′)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6)δ: 163.3 (C-4), 150.9(C-2), 140.9 (C-6), 101.9 (C-5), 87.8 (C-1′), 84.9 (C-4′),73.7 (C-3′), 70.0 (C-2′), 61.0 (C-5′)。以上数据与文献数据[21]进行对比，鉴定化合物13为尿苷。

4 讨论

采用多种分离方法，从洋金花乙醇提取物中分离鉴定了13个生物碱化合物，其中，化合物1～9、11和12为首次从曼陀罗属植物中分离得到，化合物10和13为首次从该植物中分离得到。尽管近10年来国内外学者从洋金花中发现了一些新的生物碱[21]，然而总体上来看，截至目前洋金花中分离得到的化合物仍以醉茄内酯成分[22-25]为主。因此，加强从洋金花中分离鉴定药理活性显著的生物碱成分研究是非常有意义的。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突