药用植物药效活性成分积累调控的蛋白质组学研究进展

焦松林,任建国,王俊丽

(1.贵州医科大学 公共卫生学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州省食品营养与健康工程研究中心，贵州 贵阳 550025）

药用植物在我国已有几千年的医用历史，是当今中医药学发展的物质基础。据报道，我国药用植物共计达11 118 种，涉及385 科，2 312 属[1]。其体内的药效活性成分是其发挥药理作用的主导因素，目前已知的药效活性成分主要为一些次生代谢产物，如多糖类、苯丙烷类、黄酮类、萜类及生物碱等[2]。但这些活性成分往往在药用植物体内分布甚微，储存在一定器官、组织或细胞内，并且在药用植物生长发育过程中处于动态变化，同时还易受到各种环境因子的影响[3-4]。由此可见，药效活性成分在药用植物体内的积累过程尤为复杂。

蛋白质作为生命现象的直接体现者，其结构和功能直接影响着生命活动的变化，通过对药效活性成分生物合成途径中差异表达蛋白质组的研究鉴定，可有望揭示药用植物体内药效活性成分累积调控的分子机制。当前，基于凝胶的二维凝胶电泳（2-DE）与质谱联用是药用植物蛋白质组学研究的常用技术，但基于凝胶的蛋白质组学技术往往是半定量，无法准确分离鉴定疏水性、极碱性、低丰度、超高或超低分子量的蛋白质[5-7]。近年来，一些具有高通量、高灵敏度、高重复性的无凝胶定量蛋白质组学技术[如同位素标记相对和绝对定量（iTRAQ）和串联质谱标签（TMT）多肽体外标记定量]应运而生，它们的运用极大地促进了药用植物的蛋白质组学发展[8-9]。鉴于此，本文从药效活性成分时空累积的蛋白质组学及环境因子调控活性成分生物合成的蛋白质组学方面进行综述。

1 药效活性成分时空累积的蛋白质组学研究

1.1 时间效应

对生长发育过程中药效活性成分的动态累积变化规律研究，可为药用植物的适时采挖、合理采收提供科学依据。在药用植物的生长发育过程中，药效活性成分的合成累积往往呈动态变化。有研究显示，药效活性成分的合成累积与发育程度密切相关[10]。YOU X 等[11]对龙眼Dimocarpus longan Lour.花序不同时期的2-DE 蛋白质组学分析发现，相比成花期，花序逆转期中查尔酮还原酶（CHS）、黄烷酮-3-羟化酶（F3H）及类黄酮3'-羟化酶（F'3H）表达下降使得黄酮醇在该阶段合成受到抑制。YANG B 等[12]对忍冬Lonicera japonica Thunb 不同花期的2-DE 差异蛋白质组学分析发现，1-脱氧-D-木酮糖合成酶（DXS）和牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶在花后期的特异表达促进花后期萜类合成。陈敏氡等[13]对丝瓜Luffa cylindrica 果实发育过程的蛋白质差异表达分析发现，丝瓜果实中苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸4-羟化酶（C4H）、4-香豆酰-CoA 连接酶（4CL）、肉桂醇脱氢酶（CAD）、咖啡酸-O-甲基转移酶（COMT）及过氧化物酶在发育后期表达显著上调，促进丝瓜果实中苯丙烷类、酚类等物质合成。季节变化对药效活性成分的合成累积也有着重要的影响。马朋涛[14]通过比较春、秋季节人参茎蛋白质组学发现，参与异黄酮类、类苯基丙烷化合物合成的相关酶-紫杉碱还原酶和COMT 在春季表达上调。LIU S等[15]对茶叶Camellia sinensis （L.） O. Kuntze 的生化分析表明，春季嫩芽多酚含量明显高于冬季嫩芽，通过2-DE 蛋白质组学分析发现，参与多酚合成的黄酮醇合酶（FLS）在冬季嫩芽中表达下调。此外，不同树龄的药效活性成分合成累积也有所不同。MA R等[8]运用iTRAQ 标记蛋白质组学分析发现人参Panax ginseng C.A.Mey.根中法尼基二磷酸合酶、鲨烯环氧酶（SE）及鲨烯合酶（SS）随参龄增加表达上调，加速人参皂苷的合成能力增强。麻锐等[16]对5 年生园参根和3 年生园参根的差异蛋白质组学分析发现，参与生物碱和黄酮类化合物合成的相关酶-紫檀碱还原酶和异黄酮还原酶（IFR）在5 年生参根中表达上调。

1.2 空间效应

药效活性成分的合成累积除具备生长发育的时效性外，空间效应的特异性也是其一个重要的基本特征。药效活性成分通常在不同种属或同一种属、同一植物的不同药用部位含量存在差异性。藤黄科植物金丝桃Hypericum spp.的主要药效成分金桃素和假金桃素是由其叶分泌细胞团产生和储存。吕洪飞等[17]对我国产的金桃素属9 组43 种1 亚种1 变种的植物叶分泌结构比较研究显示，仅3 组（贯叶连翘组、遍地金组和毛金丝桃组）5 种植物具有分泌细胞团，含有金桃素类化合物，其它物种体内无分泌细胞团。豆科相思子属植物鸡骨草Abrus cantoniensis Hance 的主要药效成分为生物碱和黄酮类物质，其根、茎、叶均可入药，刁璇等[18]运用超高效液相色谱（UPLC）对鸡骨草根、茎、叶及全草相思子碱和夏佛塔苷的含量分析发现，相思子碱和夏佛塔苷在鸡骨草不同药用部位的含量分布一致，表现为叶＞茎＞全草＞根。

同种属植物、相同部位药效活性成分含量的差异与其相关代谢途径中酶活性的变化密切相关。DENG J 等[19]对同种属白色莲Nelumbo nucifera cv. Baige和红色莲Nelumbo nucifera cv. Yehonglian 花瓣的差异蛋白质组学分析发现，花色素合成酶在红色莲花瓣中的表达上调促进花色苷积累。LI R 等[20]运用iTRAQ 标记对野葡萄赤霞珠Vitis vinifera cv. Cabernet Sauvignon 和野葡萄丹凤2 Vitis quinquangular cv.Danfeng-2 的蛋白质组学分析发现，CHS、F3H、查耳酮异构酶（CHI）、类黄酮3'，5'-羟化酶（F3'5'H）、二氢黄酮醇-4-还原酶（DFR）及UDP 类黄酮葡萄糖基转移酶（UFGT）在野葡萄赤霞珠成熟果实中表达上调促使果实内花青素等黄酮类化合物的合成。ZENG S 等[21]也运用iTRAQ 标记蛋白质组学分析发现，相比黑果枸杞Lycium. ruthenicum Murr. ，宁夏枸杞Lycium.bararum L.成熟浆果中1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶（DXR）、ζ-胡萝卜素脱氢酶和ζ- 胡萝卜素异构酶的特异表达促进果内类胡萝卜素大量累积。

同一植物、不同部位药效活性成分含量的差异与其相关代谢途径酶活性的变化也密切相关。陈驰等[22]运用2-DE 蛋白质组学分析发现桑树Morus alba L.雌花花柱中异黄酮含量高于子房组织是由于IFR、F3H 在雌花花柱中的特异表达所致。而ZHU W 等[23]对桑树根、茎、叶的无凝胶/无标记蛋白质组学（Gel-Free/Label-Free）分析发现，根中CHI 和F3'5'H 的特异表达促进根中黄酮醇含量累积。ZHU W 等[24]也运用Gel-Free/Label-Free 蛋白质组学技术发现十大功劳Mahonia bealei Carr.根中小檗碱的高度累积是由于（S）-四氢小檗碱氧化酶在根部特异表达的结果。

2 环境因子调控药效活性成分的蛋白质组学研究

2.1 温度

适度的温度调节有利于药效活性成分的合成累积，高温或低温都会影响到药效活性成分相关合成酶的表达[25]。KIM S W 等[26]对人参叶片的热应激（35℃）蛋白质组学发现，人参皂甙合成途径中的异戊烯基焦磷酸异构酶、羽扇豆醇合酶和糖基转移酶的表达量受热应激调节而发生变化。乌凤章等[27]运用iTRAQ 标记蛋白质组学技术分析发现笃斯越橘Vaccinium uligiuosum L.扦插苗在4℃低温诱导下，枝条中PAL、CHS、F3'5'H、UFGT、F3H 和FLS 表达上调促使黄酮类化合物合成，从而致使幼苗免受寒冷引起的氧化胁迫，提高低温耐受性。

2.2 水分

水分是药用植物生存的必要条件，参与生长发育的全部过程。有研究证实，适度干旱胁迫有助药用植物中药效活性成分的积累[28]。WANG Y 等[29]运用iTRAQ 标记蛋白质组学技术对茶树响应干旱胁迫显示，在轻度干旱胁迫5 d 后叶片中PAL、4CL、COMT 和CAD 表达上调，促进木质素等多酚成分的合成。ZADRAŽNIK T 等[30]运用2D-DIGE 蛋白质组学发现菜豆Phaseolus vulgaris L.在干旱胁迫17 d后叶片中DXR 和2-C-甲基-D-赤藓糖醇-2, 4-环二磷酸合酶表达上调，加速萜类骨架合成。

2.3 紫外辐射（UV-B）

UV-B 是太阳辐射中的一种中波紫外辐射。近年来随着臭氧层的破坏，到达地球表面的UV-B 辐射随之增加，对植物的生长发育造成了众多不利影响[31]。为了适应生存条件，药用植物可通过诱导黄酮类化合物的生物合成来抵御UV-B 辐射[32]。 虞姣姣等[33]发现UV-B 能诱导引起桑叶体内黄酮生物合成途径的改变，致使桑辛素和查耳酮大量合成。通过2-DE 的差异蛋白质组学分析表明，UV-B 诱导促使桑叶中CHS 表达上调，这为黄酮类化合物的合成提供充足的前体。类似的研究在银杏Ginkgo biloba 也有报道[34]。除黄酮类化合物外，生物碱和萜类等药效活性成分也能对UV-B 起到一定的防御作用[35]。ZHU W 等[36]发现在UV-B 辐射和黑暗孵育双元胁迫下，长春花Catharanthus roseus 叶片中的苦豆碱、长春碱及长春花碱均显著增加。通过蛋白质组学分析发现，参与吲哚生物碱生物合成的香叶醇-10-脱氢酶表达上调。GAO C 等[37]通过2-DE 蛋白质组学技术发现铁线莲Clematis terniflora DC.在UV-B 辐射和黑暗孵育双元胁迫下，叶片中苯甲酸合成酶、色氨酸合酶的表达上调，这为吲哚生物碱合成提供了更多前体。ZHANG L 等[38]运用2-DE 蛋白质组学技术发现忍冬花蕾在UV-B 照射下DXR 表达上调，促进萜类骨架生物合成。

2.4 盐分

盐胁迫是一种常见的环境胁迫，会引起植物渗透压和离子平衡紊乱[39]。药用植物作为自养生物，具有合成积累特定次生代谢产物的能力，以获得对盐胁迫下的竞争优势。李波等[40]发现紫花苜蓿Medicago sativa 幼苗在150 mmol/L Na2CO3/NaHCO3盐胁迫3 d后，苯丙烷类成分合成途径被激活，从而增加了幼苗对盐胁迫抵御能力。通过iTRAQ 标记蛋白质组学分析发现，叶片参与苯丙烷类合成的PAL、COMT 表达上调。WANG C 等[9]运用TMT 蛋白质组学技术分析发现到甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch 在50 mmol/L NaCl 轻度盐胁迫50 d 后根中， PAL、C4H、4CL、CHI、FLS、F3'H 表达上调，促进了黄酮醇的合成累积。WANG X 等[41]运用2-DE 蛋白质组学技术分析发现海莲子Salicornia europaea L.幼苗在200 mmol/L NaCl 适度盐胁迫下，嫩芽组织中胆碱单加氧酶、甜菜碱醛脱氢酶表达上调，进而促进甜菜碱合成。

2.5 外源植物激素

外源植物激素是一类由人工合成且具有内源植物激素调节植物生长发育作用的有机物质，可以通过影响内源激素变化，进而调控次生代谢产物的合成累积[42-43]。外源植物激素对药效活性成分的诱导调控各有不同，BHATTACHARYYA D 等[44]运用2-DE蛋白质组学分析发现鬼臼Podophyllum hexandrum Royle 经茉莉酸甲酯（MeJA）处理9 d 后，COMT和咖啡酰-CoA 甲基转移酶被诱导上调表达，促进了鬼臼毒素的合成累积。LI J 等[45]运用iTRAQ 标记蛋白质组学分析发现，广藿香Pogostemon cablin Benth. 在MeJA 及MeJA 与乙烯混合液诱导后，叶片中DXR、DXS、4-羟基-3-甲基-丁-2-烯基二磷酸合酶和4-羟基-3-甲基-丁-2-烯基二磷酸还原酶表达下调，导致萜类骨架合成受抑。另外，CHS的表达下调，也抑制了下游途径中黄酮类化合物的形成。

2.6 生物因子

药用植物的药效活性成分合成累积除受到非生物因子影响外，还受到来自动、植物及微生物等生物因子作用。植物病原菌通过侵染寄主引起病害，从而造成药材品质下降。人参受到Rhexocercosporidium panacis 感染可引起的人参红皮病，表皮呈现红褐色、不规则状的病斑，随着病害加重，病斑颜色变为深红色至黑色，最终导致经济价值降低[46-47]。MA R 等[48]运用iTRAQ 标记蛋白质组学技术分析发现，感染红皮病的人参根中SE、SS 及细胞色素P450 单氧化酶表达下调，导致人参皂苷合成受抑，产品质量下降。但也有研究证实药用植物可以通过合成植保素来抵御病原菌胁迫[49]。XU X B 等[50]运用2-DE 蛋白质组学技术分析发现铁皮石斛Dendrobium officinale 幼苗经Mycena dendrobii 感染后，根中CHS 和F3H 被诱导高水平表达，进而促进黄酮类化合物合成。DAI F 等[51]运用iTRAQ 标记蛋白质组学技术分析发现桑树经Ciboria carunculoides 感染后，桑果成熟早期PAL、4CL、DFR 均上调表达，促进黄酮类化合物的生物合成。ZULAK K G 等[52]运用2-DE 蛋白质组学技术分析发现罂粟Papaver somniferum 经Botrytis cinerea 感染后，去甲乌药碱-6-O-甲基转移酶、（S）-乌药碱-N-甲基转移酶, N-甲基乌药碱-3'-羟化酶、3'-羟基-N-甲基乌药碱-4'-O-甲基转移酶及小檗碱桥酶表达均上调，促进血根碱的合成。

3 展望

蛋白质作为基因表达的产物，能直观地反映生命活动的本质现象。近年来，蛋白质组学逐渐成为后基因时代的热门研究工具之一，能够较为全面地分析药效活性成分在药用植物体内的时空积累分布特性及环境因子的调控成因，从而间接地反应了道地药材形成的理论基础。但由于蛋白质组学技术运用于药用植物的研究发展时限尚短，还存在诸多的不足：如蛋白质提取技术有待优化；低丰度蛋白检测水平还有待加强；药用植物的生物数据库不健全；药效成分的部分生物合成机制尚不明确等。因此，蛋白质组学与系统生物学中的其它组学技术（基因组学、翻译后修饰组学、代谢组学等） 整合将有望成为今后探讨药效活性成分合成积累的重要方向。