Müller细胞在糖尿病黄斑水肿中的作用及机制

朱少进 综述 方严 审校

安徽理工大学第一附属医院 淮南市第一人民医院 安徽理工大学 232001

目前，全球大概有4.15亿人患有糖尿病，预计到2040年患者人数将达到6.42亿人，据统计，约有35%的糖尿病患者会发生糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)，常表现为视力逐渐受损[1-2]。糖尿病致盲的主要原因是糖尿病黄斑水肿(diabetic macular edema,DME)，其在糖尿病人群中的患病率约为6.8%[3]，可发生于DR的任何阶段。DME的形成机制比较复杂，主要包括2个方面：(1)在病理条件下，血-视网膜屏障(blood-retinal barrier,BRB)被破坏，视网膜内液体渗漏；(2)液体吸收机制受损，液体的产生与吸收机制紊乱，导致视网膜下液体产生，聚集在黄斑中心处而形成DME[4-5]。Müller细胞作为视网膜中主要的大型胶质细胞，横跨视网膜，与视网膜中的神经元、微血管和突起相接触，在维持视网膜的结构与功能方面扮演重要角色。为了深入认识Müller细胞参与DR的发生途径，本文就Müller细胞在DME中的作用机制进行综述，以期为治疗DME提供新策略。

1 Müller细胞

Müller细胞贯穿视网膜各层，胞体主要位于内核层，两端的突起从玻璃体表面的内界膜穿越至外界膜，包绕着各类视网膜神经元，并与视网膜中的微血管建立了重要联系[6]。视网膜特异性的“神经-血管耦连”机制与Müller细胞、血管和神经元紧密关联，同时这种“代谢共生”的关系对维持视网膜的稳定性十分重要[7]。作为视网膜的支架，Müller细胞参与视网膜的发育和形成，并对其完整性具有支持作用；此外，在生理条件下，Müller细胞可以通过多种途径参与信号转导、信息传递、调节视网膜内离子和水等物质动态平衡，通过代谢为神经元提供必要的营养支持，通过分泌各类生长因子和炎性因子来维持BRB的稳定性[8]。任何干扰视网膜稳态的因素都会影响Müller细胞的正常功能，进而影响整个视网膜功能。在DR发生和发展过程中，Müller细胞由于长期处于低氧高糖的环境下，其结构与功能均有所改变，反应性胶质增生、细胞肿胀、凋亡、水及电解质调节紊乱和BRB通透性增加等，均可促使黄斑中心凹和周围间隙液体积聚，从而导致视网膜水肿和黄斑水肿。

2 Müller细胞在DME中的变化及作用

2.1 Müller细胞形态结构的变化

Müller细胞由细胞核、胞体和内外侧突起组成，胞体突起由内向外发出，垂直高度与视网膜厚度接近，细胞核位于内核层，染色观察为椭圆形或多角形，核周胞质比较少[9-10]。在DR早期，视网膜神经纤维层、神经节细胞层和内丛状层中Müller细胞的形态结构发生变化，胞体肿胀，空泡化程度加深，细胞器减少，细胞凋亡增多。目前大多数研究认为黄斑水肿形成的主要机制是细胞外液的积聚，但有迹象表明囊样黄斑水肿与Müller细胞肿胀和凋亡相关[11-12]。荧光素眼底血管造影检查结果显示，部分DME患者的血管并未出现明显渗漏，这说明有些DME可能是Müller细胞肿胀引起。为了进一步探讨Müller细胞在DR过程中的改变，过贵元等[13]对诱导的高糖缺氧条件下糖尿病大鼠视网膜组织的观察中发现，在培养的第8周，Müller细胞的胞体开始膨胀，线粒体肿大、嵴溶解，随着DR病程的延长，其空泡化程度越明显；在第24周时，细胞核向外迁移到内核层最外侧，胞体水肿加深，Müller细胞这些改变为临床中囊样黄斑水肿的形成提供了参考依据。Fehér等[14]通过对38例人视网膜组织观察，其中28例来自糖尿病患者，10例来自非糖尿病患者，认为随着糖尿病发展，Müller细胞逐渐转化为分化程度较差的神经胶质细胞，细胞的形态结构也逐渐出现上述改变。王心蕊等[15]发现兔视网膜Müller细胞在高糖状态下细胞核缩小，粗面内质网高度扩张呈空泡状，染色质增多、凝结和边聚，细胞表面微绒毛减少变钝。这些细胞显微结构的改变可以诱导视网膜微血管异常，从而诱发DME的形成。这些研究表明Müller细胞长期在高糖缺氧环境因素的影响下，其形态结构发生异常，细胞出现水肿甚至凋亡，这是DME形成的重要因素，囊样黄斑水肿是特征类型表现。这种改变可能是DR发生功能性变化的基础，与糖尿病病程及血糖浓度等因素密切相关。

2.2 Müller细胞引起的BRB功能异常

Müller细胞不仅可以释放细胞因子和调节水及电解质的转运，还能参与BRB的形成。一旦BRB形成异常，将会引起DME的形成。紧密连接和视网膜的内外2层屏障是维持BRB稳定的重要因素，若血管内皮细胞或紧密连接受到各类因素的损伤，将会通过破坏内外层屏障影响BRB的正常结构与功能，增加其通透性，加速微血管内液体的渗出，这是视网膜下液来源的重要途径。

虽然在DR早期可以发现视网膜微血管渗漏，但在日常的临床诊疗中，明显的黄斑水肿症状直到局部代偿机制破坏才能形成。Müller细胞对BRB的形成具有重要支持作用，Müller细胞的凋亡会破坏BRB结构和功能。小鼠中表达调控Müller细胞的相关基因被敲除后，视网膜内不仅光感受器细胞发生凋亡，毛细血管和BRB结构也出现异常[16]，证实了Müller细胞的缺乏可导致视网膜疾病，对视神经元和微血管具有损害作用。在牛眼BRB的体外模型中，常氧条件下，与未加入Müller细胞共培养的BRB组相比，Müller细胞共培养的BRB组视网膜血管内皮细胞屏障功能有所增强；但研究发现，在低氧环境下，培养12 h的Müller细胞会增加视网膜血管内皮细胞单层通透性，使视网膜内液体的流出增多，集聚于黄斑中心处[17]。在高糖缺氧环境下，Müller细胞凋亡增加，参与BRB形成的过程发生异常，间接损伤视网膜，这是DR发生的基础，也是DME形成的关键。

此外，Müller细胞还具有分泌功能，正常视网膜Müller细胞可以分泌各类细胞因子，如血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor,PEDF)、肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)等[18]，这些细胞因子对支持BRB的完整性和稳定性十分重要。在常氧条件下，Müller细胞分泌的PEDF会抑制VEGF的表达，使视网膜组织内的VEGF处于正常稳定水平；一旦发生缺氧，Müller细胞表达PEDF将会下调，失去对VEGF表达的抑制作用，眼内VEGF的含量有所增加[19]，诱导血管内皮细胞结构异常，增加视网膜微血管的通透性，导致血管发生渗漏和新生血管，从而引起黄斑水肿。目前针对黄斑水肿的小分子药物，主要都是通过抗VEGF机制发挥作用。晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products,AGEs)是葡萄糖代谢发生异常的产物，沉积于血管基底膜[20]，也可以通过增加血管通透性破坏BRB，玻璃体内AGEs升高可促进Müller细胞分泌VEGF[21]，视网膜新生血管的形成与VEGF的表达上调密切相关。

紧密连接蛋白(occludin)是构成紧密连接复合体和维持BRB通透性的关键成分[22]。Müller细胞对occludin的表达有很大影响，叶辉等[23]发现在添加Müller细胞的组织中，上清液内occludin的表达量最多，但未添加Müller细胞的组织中occludin的表达有所下调，这与Tout等[21]发现单独培养的视网膜内皮细胞很难形成紧密连接的结论类似。Occludin的表达依赖于Müller细胞，但高糖条件会抑制Müller细胞表达occludin，从而破坏BRB的通透性。在DR发生过程中，occludin含量的下降与基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)的降解有关。Giebel等[24]在糖尿病大鼠模型的视网膜内检测出MMP-2、MMP-9和MMP-14的mRNA表达水平上升，其中MMP-9的表达最为显著，但occludin的表达明显减少，提示MMPs的降解可能会导致occludin形成障碍，可能与组织内血糖升高有关，高糖阻碍了occludin参与紧密连接的构成，这需要实验进一步验证。

2.3 Müller细胞引起的液体转运异常

视网膜内液体的转运离不开Müller细胞，若Müller细胞受损，细胞内外水和离子的动态平衡将会发生异常，引起液体在血管和组织之间的分布紊乱，促发细胞肿胀和组织间液体积聚，从而导致黄斑水肿。一般生理条件下，由于血液流动和氧化代谢作用，组织所产生的水积聚在神经视网膜层和视网膜下，主要依靠视网膜色素上皮细胞和胶质细胞转运和吸收[25-26]。钾离子通道蛋白4.1(Kir4.1)和水通道蛋白4(aquaporin 4,AQP4)对视网膜内水、电解质转运平衡至关重要。Kir4.1和AQP4分别介导K+和水转运，二者相互协调，具有功能性耦联作用[27]。AQP4和Kir4.1散在分布于视网膜血管周围和Müller细胞末端终足，二者在内界膜和小血管周围等处均可表达，这为组织内液体的转运提供了基础保障[28]。

Kir4.1是Müller细胞调节K+转运的主要通道蛋白，对维持视网膜内K+浓度的稳定具有重要意义[29]。生理情况下，视网膜神经组织兴奋产生的K+流入组织间隙，再扩散进入Müller细胞，在细胞内刺激Kir4.1，主动将K+排入毛细血管内和玻璃体腔中，细胞内的水伴随此过程也流入血管和玻璃体腔，完成一系列水转运[30-31]。由此可以看出Kir4.1对维持视网膜中各层的“干燥状态”起到关键性作用。若Müller细胞以及K+通道被破坏，视网膜K+和水的转运就会发生异常，形成视网膜水肿。在高糖和低氧环境中，Müller细胞内Kir4.1表达减少，细胞持续摄取的K+无法转运到细胞外，从而引起Müller细胞肿胀和功能障碍，视网膜组织内液体的吸收异常，导致DME的形成[6,32-33]。病理条件下，Müller细胞上调胶质纤维酸性蛋白的表达，这与Kir4.1活性降低有着重要联系[34]。在对糖尿病大鼠的视网膜神经胶质细胞的观察中发现，视网膜血管周围Kir4.1通道蛋白显著减少，K+内流减少[32]；Thompson等[35]将大鼠Müller细胞在AGEs修饰的层黏连蛋白培养皿上进行培养，检测发现Müller细胞中Kir4.1表达水平降低，且Kir4.1通道功能降低，表明AGEs修饰的层黏连蛋白抑制Kir4.1通道的表达。孙伟等[36]也发现K+通道干预剂可以调控Kir4.1的表达，增加视网膜Müller细胞中Kir4.1的蛋白含量，同时观察到在干预剂的作用下，视网膜水肿也有所减轻。

AQP4跨膜转运蛋白具有双向性，通过介导视网膜组织间隙中的水进入Müller细胞，同时调节细胞内的水转运至微血管和玻璃体腔内，以实现视网膜内水转运的平衡[37]。缺氧环境下，视网膜内AQP4表达明显增多[38]，Müller细胞转运机制发生异常，以此促进视网膜血管中的水分快速转入组织间隙，引起视网膜下液增多，集聚于黄斑处而形成DME；同样病理条件下，K+通道下调会导致AQP4-K+介导水转运的偶联解除[39]，引起Müller细胞及视网膜血管水通量发生变化，也会导致水在细胞质中积累，促进视网膜水肿的发生。在DR中，Müller细胞的排水能力降低，AQP4和Kir4.1移向细胞的外部，其他水通道蛋白AQP1和AQP9也在细胞表面表达[40]，这些水通道的改变是加速视网膜下液体汇聚的重要原因。

AQP4和Kir4.1参与了DR的发生过程，是形成DME的重要机制之一，其作用机制解释了部分黄斑水肿对抗VEGF应答不敏感的现象，可能是Müller细胞对视网膜内离子和水转运调节紊乱所致，提示我们可以通过干预Müller细胞的途径对DME进行防治。

3 Müller细胞在DME进展中的保护作用

由于Müller细胞在视网膜的特殊分布与功能，其对视网膜损伤具有一定保护和修复作用。Müller细胞作为视网膜主要内源性神经干细胞，在视网膜损伤后，可以进入细胞周期增生并分化为神经细胞，以弥补光感受器细胞和神经节细胞受损带来的影响，但完全实现这一过程仍需复杂而漫长的过程。在DR早期，Müller细胞被激活产生应激反应，可分泌相关细胞因子为视网膜提供保护。研究发现神经生长因子通过作用于原肌球蛋白相关激酶(tropomyosin-related kinase,Trk)A受体[41]，释放碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)，开放K+和Cl-通道，抑制神经胶质细胞的渗透性肿胀；脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)通过激活TrkB和bFGF受体抑制Müller细胞的肿胀，减轻视网膜水肿；神经保护剂的应用在DME的防治中具有良好的前景，为其治疗提供了新的选择。IL-6可以预防高血糖引起的Müller细胞功能障碍和损伤，维持正常的神经元功能[42]；在视网膜脱离模型中，IL-6基因的缺失常导致感光细胞死亡数量显著增加[8]；也有研究发现IL-6可以保护视网膜神经节细胞，避免眼压升高导致的视野损伤[43]；这些研究提示在DME发生过程中，Müller细胞通过分泌IL-6可以保护视网膜神经节细胞，以此为黄斑水肿造成的视力损伤提供保护。Müller细胞可通过VEGF/VEGFR2特异性信号传导途径，诱导神经营养因子释放，对高糖环境下视网膜中的神经元提供必要保护[44]。糖尿病小鼠视网膜内BDNF和细胞衍生神经营养因子的急剧减少，被证实与VEGF/VEGFR2信号传导途径直接或间接释放营养因子密切相关[6]。

目前对DME的治疗大多集中在抗VEGF治疗方面，通过降低眼内VEGF的含量维持BRB的完整性和稳定性，减少视网膜内液体的渗出。但在临床诊疗过程中，我们发现仍有许多DME患者经过多次抗VEGF治疗，黄斑水肿并未见明显消退或消退后又不断复发，常称之为难治性黄斑水肿。这类现象可能是由于长期使用抗VEGF药物破坏了Müller细胞介导的VEGF/VEGFR2特异性信号传导途径，减少神经因子释放，因此达不到满意的治疗效果。研究发现，玻璃体腔内注入地塞米松缓释剂对于治疗难治性黄斑水肿有一定作用[45]。地塞米松被证实是通过降低视网膜血小板衍生生长因子受体α的水平而增加微囊蛋白-1(caveolin-1)的含量，同时诱导生成caveolin-5，调节AQP4的功能和改善Müller细胞的作用，以维持BRB的完整性，降低视网膜水肿的发生率[46-47]。

在DR发展过程中，视网膜Müller细胞既会损伤视网膜组织，同时对其也有保护作用。未来可以将Müller细胞作为DME的治疗靶点进行研究，通过干预Müller细胞的形态结构改变、细胞凋亡和信号转导等途径，充分发挥Müller细胞的神经保护作用及再生能力，为治疗DME以及其他视网膜疾病提供新的思路。

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