丝素支架应用于骨组织工程的研究进展

于潇 马勇△ 郭杨 潘娅岚 涂鹏程 过俊杰

骨组织工程将材料工程与生物学相结合，制作三维支架，以模拟天然骨组织的结构和功能，从而达到修补替换天然组织的目的。其三大基本要素包括种子细胞、生长因子和支架。支架作为组织工程中的核心部分，其材料的选择及制备工艺一直备受关注。

研究者引入了多种天然或合成聚合物材料以及不同的加工方法用于支架的开发研究，以重建天然骨基质，填补骨缺损。丝素蛋白作为一种天然高分子纤维蛋白，凭借其来源广泛、易水解且水解速率易于调控、良好的生物相容性与低免疫性、易于多种生物活性分子及矿物共混等优点，在组织工程领域获得广泛应用。

本文对近年来丝素支架应用于骨组织工程的研究进展进行综述，多角度介绍丝素支架性能，重点阐述多种形态丝素支架在骨组织工程中的应用。随着研究的深入，越来越多的研究者关注于支架植入后宿主反应，包括局部免疫微环境的改变及炎症反应。因此，对近来提出的支架的免疫微环境调控策略加以概括。最后，对目前研究中仍存在的问题提出作者的看法并指出未来的研究方向。

1 丝素支架性能

支架在种子细胞迁移、增殖、分化的过程中，为其提供生物力学支持，因此支架需要提供与天然骨组织接近的力学性能、孔径、孔隙方向、孔隙率和表面化学性质，以促进种子细胞的迁移、增殖以及分化。

1.1 机械强度

常用于组织工程的脱丝胶丝素具有300～740 MPa的拉伸强度、10～17 GPa的拉伸弹性模量、4%～26%的断裂应变[1]。然而，在蚕丝溶解过程中使用的溶剂往往容易导致分子间氢键的不可逆断裂，导致人工制造的丝素蛋白无法达到天然蚕丝的强度。通过改变丝素蛋白纤维的构象，将丝素由不稳定ɑ-helix结构转变为更为稳定的β-sheet结构，可以调节丝素的机械强度。例如，提高共混溶液中丝素的含量[2]、在处理丝素溶液的过程中掺入金属离子(如Cu2+、Ca2+、Zn2+、Fe3+等)[3]、使用激素类物质[4]等措施，均可以改变丝素蛋白纤维的构象，诱导β-sheet结构的产生。此外，纳米级HAP等矿物的矿化作用也是提高丝素蛋白机械性能的有效途径。

1.2 可降解性与生物相容性

理想支架的降解速率应与骨再生速度相协调。过快的降解速率，使得支架不能提供适当的微环境来保护细胞增殖和分化。过低的降解速率可能导致支架残留物变成异物残留，引起炎症反应，从而阻碍骨缺损部位的修复。作为一种蛋白质，丝素易被蛋白酶XIV、ɑ-糜蛋白酶和胶原酶IA等多种酶降解[5]。其降解速率与丝素Ⅱ(即β-sheet)的比例负相关[6]。在处理蚕丝的过程中使用不同的溶剂可以通过控制β-sheet的数量和二级结构，将生物降解率控制在几周到12个月[7]。有机溶剂处理的支架在体内降解需要12个月甚至更长时间，而水处理的支架在体内降解时间则不超过6个月[8]。同时，支架的降解产物不应对人体组织产生不利影响。丝素在降解过程中释放的多肽有助于控制炎症和成骨细胞产生胶原，此外，丙氨酸和甘氨酸作为组成丝素的主要氨基酸，同时也是丝素降解的副产物，均可以被用于合成新的蛋白，从而避免了副产物在局部的蓄积[9-10]。在体内外的条件下，丝素生物材料所引起的免疫反应程度与现下正广泛使用的医用植入物并无不同，现已广泛应用于外科缝线及敷料中[11]。

1.3 孔径与孔隙率

在诸多支架性能中，孔径与孔隙率一直被视作设计支架的重要数据，对于细胞成分、新生血管的形成以及支架本身的降解率都有重要影响。但是，最适的孔径仍存在争议，Karageorgiou等则推荐孔径在300～400 μm，这也是能观察到毛细血管长成的临界数值[12]；也有研究者提出孔径在150～300 μm之间的支架，和更小孔径的支架相比有着更好的细胞黏附[13]。不同孔径大小的支架对细胞分布的影响大于对细胞数量影响。细胞在较小的孔(200～500 μm)上均匀填充，而在较大的孔(1 000～1 500 μm)的孔壁上密集生长，导致沿孔壁的细胞与细胞之间的相互作用更紧密，正是这些更紧密的细胞相互作用增强了成骨反应[14]。较大的孔径引发成骨，而较小的孔径则导致血管形成受限和缺氧。局部的缺氧会增强局部炎症反应，最终导致肉芽组织的形成，并包绕植入体，阻止了进一步骨化的发生。其潜在机制可能与巨噬细胞的极化相关，孔径的增大导致了M2表型表达的上调和M1表型表达的下调[15-16]，其中M1表型巨噬细胞启动血管生成，而M2巨噬细胞促进血管成熟[17]。

2 多种制备工艺生产丝素支架在骨组织工程中的应用

细胞外基质(ECM)是组织细胞合成及分泌的结构蛋白、多糖、酶等分子构建的局部微环境，组织细胞与ECM的双向交互作用决定了组织细胞的生长分化。原生ECM在诱导良好的免疫环境，特别是巨噬细胞极化的同时诱导组织重塑[18]。原生的ECM和基于原生ECM的支架可以降低异物反应并在支架植入后调节免疫细胞抗炎表型[19]。因此，良好的支架需要在体内提供与ECM相类似的三维结构以及免疫微环境。为了尽可能的复制原生ECM的结构，研究人员从支架材料、形态以及制作工艺等方面进行了多种尝试。

2.1 三维多孔支架

三维多孔支架独特的结构有利于细胞附着、增殖和迁移，并可促进营养和代谢废物的运输。常用的制备方法有粒子沥滤法、冷冻干燥法以及3D打印法等。

粒子沥滤法将一定的成孔剂溶解于丝素溶液中，随后的溶剂蒸发导致在丝素基体中嵌入盐颗粒。丝素基体在去离子水中浸泡后，支架上的盐颗粒浸出，形成多孔结构。成孔剂的选择决定了支架孔径与孔隙。Zhang等[20]以Na2CO3为成孔剂，用丝素蛋白与羧甲基壳聚糖、锶取代羟基磷灰石、纤维素纳米晶制得3种复合支架，成孔率分别为90.09%±0.19%、84.28%±2.05%、82.03%±1.45%，其中Sr-Hap/CNCs/SF/CMCs支架表现出最高的OPN和BSP表达。纳米级矿化物的加入，提高了支架的机械性能及表面粗糙度，但是会造成孔径、孔隙率及溶胀率的下降。Correia等[21]使用不同大小颗粒NaCl作为成孔剂，水溶液和六氟异丙醇(HFIP)作为溶剂，分别制得四种支架，其中400～600 μm的HFIP-SF支架表现出最优的成骨能力。但是，有机溶剂的使用不可避免的增加了免疫反应风险，降低了支架的生物相容性。

冷冻干燥法通过冰晶的升华作用在三维支架内形成孔隙，可以避免有机溶剂的使用。Wang等[22]通过冷冻干燥法制得氧化石墨烯-羟基磷灰石-丝素复合支架，该支架外层致密含有5～15 μm的微孔，中间层疏松伴有15～30 μm的带状孔隙，内层呈海绵状孔隙大小为30～65 μm。和单纯HAP-SF支架相比，具有更高的机械强度和蛋白吸附能力。层状结构和球状结构相比，更贴近于板层骨结构，有利于种子细胞向板层骨分化，带来更高的机械强度。高温度梯度的快速冻结有利于纳米纤维和定向结构的形成。在-80 ℃下冻结的SF支架具有由随机短通道/孔/纳米纤维组成的混合结构，但短通道和孔不相互连接。相比之下，在-20 ℃冻结的SF支架中只观察到没有很好地连接成网络的随机气孔[23]。Gokila等在-80 ℃下制得具有典型的网状结构纳米壳聚糖/丝素蛋白/透明质酸支架，有着良好的增殖速率和细胞定植，同时保留了纳米壳聚糖的抑菌效应[24]。抗菌效应的保留对丝素支架可以一定程度上避免植入后的感染。

3D打印法通过计算机预设支架内部结构，可以极大程度上克服粒子沥滤法及冷冻干燥法所制支架内部结构上的随机性。近年来，新兴的生物打印技术通过CAD技术来规划种子细胞的精确位置，然后逐层打印，可以实现活体细胞的3D打印。Suntivich等[25]将丝素聚合物逐层组装成具有典型的“巢”状结构的支架，细胞在没有损害其完整性的情况下被成功地种植到这些“丝巢”中。使用数字光处理辅助3D生物打印技术可以解决喷墨和挤压打印的部分缺点，例如对被包封的细胞施加较大的机械应力或由于打印时间长而致细胞活力的降低[26]。使用甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)将SF溶液甲基丙烯酸化可以提高SF基生物油墨的机械性能及流变性能，同时可以实现不同细胞的多层印刷[27]。这使得具有多种细胞类型的生物组织可以被复制，特别是涉及软骨面的骨缺损。

2.2 静电纺丝支架

在静电纺丝中，高压产生的电势差使丝素溶液自喷射板中喷出，并在喷射过程中迅速蒸发，形成固体纤维。多种营销因素决定了电纺丝素纤维的性能。电纺丝素纤维的直径随溶液浓度的增加而增大，当丝素浓度低于20%无法成功纺丝，而高于30%则无法形成圆形截面纤维[28]。温度及相对湿度的升高是造成纤维不均及不良纺丝的重要因素。在30 ℃和25%相对湿度的条件下，可以制造出最高的抗渗透性和整体上最均匀的纯丝蛋白纤维[29]。Kim等[30]通过电纺丝制备了一种经干扰素处理的纳米丝素支架，不仅使植入其上的hMSCs有着良好的增殖与迁移，还提高免疫调节功能性细胞因子，IDO和COX2的表达。Gao等[31]通过电纺丝制得具有分层结构的矿化纳米丝素支架，在保持良好孔径与孔隙率的同时将压缩模量和应力分别是提高了32.8和3.0倍，分层结构则显著增加了细胞粘附和增殖与间充质干细胞向成骨细胞的分化。通过电纺丝生产的丝纳米纤维通常具有ɑ-helix结构或低稳定性的无规卷曲构象。这些纳米纤维垫需要浸入有机溶剂(例如甲醇)中，以诱导在纳米纤维中形成更稳定的反平行β-sheet结构。但是，使用有机溶剂和腐蚀性溶剂可能会破坏生物分子的结构和生物活性。因此，最好在静电纺丝前使用更温和的手段避免使用有机溶剂以最大限度地减少残留溶剂的毒性作用。红外光谱证明，在静电纺丝前使用简单的超声波处理溶液可以一定程度上调节溶液的黏度，在电纺基质中诱导水稳定性。流变性能测试表明，超声处理显著提高了溶液的黏度，进一步提高了电纺纤维的质量，改善了干、湿条件下的力学性能[32]。

3 丝素支架的免疫调节手段

骨生物材料的植入后的免疫反应对随后的成骨和骨整合有着重要影响。丝胶作为蚕丝中含量第二的蛋白质，通常被认为是引发免疫应答的关键因素。可能与丝胶上调的肿瘤坏死因子-ɑ的表达有关[33]，而掺入4-己基间苯二酚(4HR)则可以抑制这一过程，增强成骨[34]。但是，也有研究员制得掺有不同浓度丝胶的丝素支架，各组之间促炎性标志物TNF-ɑ、CXCL10和CD197的基因表达与无丝胶组相比并无明显差异[35]。亦有部分研究同样支持丝素丝胶共混，丝胶蛋白引发的类骨羟基磷灰石结晶形成，或有利于骨形成[36-37]。对于各研究者得出的不同结果，可能与处理蚕丝的过程中脱丝胶过程及丝胶的制备工艺有关，因此，丝胶对免疫反应的影响尚需进一步研究。

植入物诱导多核巨噬细胞的浸润导致肉芽肿形成是移植失败的主要原因。巨噬细胞是宿主对生物材料反应的第一反应者，并且已被证明是下游组织重塑事件的预测因子。同时，具有高度可塑性的巨噬细胞使得通过改变支架成分及结构来调节免疫成为可能。近年来，多种措施被应用于调节免疫微环境，包括：1)通过支架表面修饰以改变拓扑结构及粗糙度，调节免疫细胞与支架材料之间的相互作用[38]。支架的表面是第一个与生理环境和细胞相互作用的场所，表面粗糙度的增加促进了细胞与蛋白质宿主位点的相互作用，对细胞附着和密度有着深远的影响。有研究员提出理想的骨种植体，表面粗糙度应在1～2 μm[39-40]。未经处理的丝素蛋白表面粗糙度平均为40 nm，经乙烯基磷酸(VPA)浸泡、乙烯基磺酸(VSA)浸泡、臭氧中紫外线照射(UV/O3)处理后，均可使丝素蛋白的表面粗糙度提升，而碳酸氢钠(NaOH)浸泡、丙烯酸(AAC)浸泡的处理则能减低丝素蛋白的表面粗糙度[41]。有机化合物的使用在提高丝素表面粗糙度的同时不可避免的提高了免疫原性，因此需要更温和的手段实现表面粗糙度的提升。2)通过控释方式掺入生物活性元素来调控免疫反应[42-44]。掺有镁离子的材料可上调巨噬细胞促炎细胞因子，包括TNF-ɑ和IL-6的表达，而与骨修复相关的TGF-β1细胞因子[45]。Wang等[46]证实掺入Sr的SrHA/SF纳米球比HA/SF纳米球有着更高的成骨分化潜能。掺入的金属离子的支架需严格控制支架的降解及离子的控释，以免造成异物沉积。3)掺入生物活性因子如巨噬细胞诱导剂或炎性细胞因子。Spiller等[47]设计了吸附有干扰素-γ(IFNg)及白介素4(IL4)的骨再生支架，以短时释放IFNg促进巨噬细胞M1表型，然后持续性释放IL4促进M2表型，利用宿主巨噬细胞的血管生成行为来实现支架血管化。4)与免疫调节药物联用。与硫酸软骨素共联后的丝素支架降低了IL1-β介导的炎症反应[48]，这与文献中证明的硫酸软骨素的免疫调节及骨整合作用相一致[49]。联用免疫调节药物时，控制药物的初始突释至关重要。通过改变丝素纤维的直径和厚度，可调节药物的释放动力学。

4 展望

骨组织工程致力于开发一种与骨组织微环境相似的骨植入物，旨在通过结合骨祖细胞和生长因子募集细胞进入由各种生物材料制成的支架中来促进骨修复和再生。这些生物材料提供必要的机械支持，具有足够的血管化能力，以允许获得营养物质支持，并尽可能少的引起免疫反应。有研究员提出了骨免疫调节能力(Osteoimmunomodulation，OIM)的概念，即诱导良好免疫反应的能力，并将其作为生物材料筛选的标准[50]。但是，关于丝素支架不同特征引起的不同免疫反应的内在机制尚缺乏研究。同时，对于不同的免疫细胞和干细胞的相互作用和分子机制的研究目前大多集中于巨噬细胞，包括B细胞和T细胞在内的多种免疫细胞仍需在体内外进一步深入研究，为通过支架在体内更好地调节这些细胞提供理论依据。另一方面，在丝素支架制备过程中使用的有机溶剂及各种改性剂会显著提高支架的免疫原性。开发新型可以完全蒸发或洗掉的改性剂，抑或开发新型纯丝素蛋白纤维支架是解决该问题的不错选择。此外，外源生物活性成分的应用，导致了一些尚未解决的关键问题，如无法控制的再生和潜在的癌症风险，限制了丝素支架的应用。因此，在应用于人体之前，尚需要开发更为安全的生长因子。总之，对于骨组织工程支架的设计应考虑成骨能力、免疫调节能力及安全性等多方面因素，以实现良好的组织修复。