大鼠深低温停循环模型研究进展

唐 卓， 刘 宇

1.中国医科大学 研究生院，辽宁 沈阳 110122；2.北部战区总医院 心血管外科，辽宁 沈阳 110016

自1951年，Gibbon发明体外循环(cardiopulmonary bypass，CPB)技术以来，CPB一直作为心脏外科的基石[1]。儿童复杂先天性心脏病和成人主动脉弓病变的修复往往需要CPB和深低温停循环(deep hypothermia circulatory arrest，DHCA)的支持[2]。尽管DHCA为手术提供了无血视野，有效地提高了患者的存活率，但其对氧化应激、止血和炎症通路有显著的刺激作用，这些均与围术期脑损伤的发病机制有关[3]。有研究发现，DHCA后谵妄和认知功能障碍的发生率约为25%[4]。目前，DHCA损伤的潜在机制尚未明确阐明[5]。为了探索DHCA后器质性功能障碍的确切机制，需要建立安全、简单的动物模型，以改善预后。现就大鼠DHCA模型研究现状作一综述。

1 大鼠DHCA模型的优势

由于大型动物的解剖结构和大小与人类相似，最初用于CPB/DHCA研究的动物模型为犬、猪和羊等[6]。然而，大型动物CPB/DHCA模型存在成本高、缺乏神经认知功能评估方法、长期恢复困难等缺点[7-8]。近年来，大鼠作为一种小型啮齿动物，备受众多学者的关注，其原因如下：(1)价格低廉；(2)与人类心血管系统解剖结构相似；(3)在基因和蛋白质水平上有丰富的检测手段；(4)实验过程简便，可独立完成[6，9]。因此，CPB/DHCA的大鼠模型可允许更大样本量的研究及长期神经学结果的评估。

2 大鼠DHCA模型的建立与发展

1967年，Popovic等[10]首次对大鼠CPB模型进行了描述。随后，大鼠CPB模型不断被开发改进[11-13]。然而，其大多采用完全的胸骨切开术，忽略了CPB后大鼠长期生存的问题；同时，使用具有较大预充体积的鼓泡或膜式氧合器，利用供体大鼠的血液启动CPB，因此，体外氧合引起的炎症反应的研究受到输注供体血液的影响[14]。

近年来，较完善的大鼠DHCA模型已被提出。2011年，Waterbury等[15]对大鼠CPB管路进行了改进，其采用外周插管技术，将20 G套管针置入左股动脉作为动脉灌注，22 G套管针置入右股动脉作为血压监测，右颈总静脉采用改良的4孔16 G口径血管导管置入右心房进行静脉引流；同时，在CPB管路中，使用真空辅助静脉引流、热转换器及微型新型氧合器；当CPB开始后，调节氧合器气体流量并维持在1.0～2.5 L/min；将大鼠冷却至14℃～18℃，循环停止后，DHCA持续15 min，再将大鼠重新加热至34℃～35℃。通过这些改进，大鼠灌注流量可达到100～150 ml/(kg·min)，与临床人体CPB流量相符。这一模型的建立为CPB和DHCA的进一步研究提供了一个简单的研究系统。2018年，Jiang等[16]对大鼠DHCA模型做出了进一步的改进，其采用临床输液器改装的封闭回路，替代既往用重力辅助静脉引流的方式。术中运用负压监测器维持负压<-60 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，从而避免血细胞损伤。整个CPB回路由8 ml 6%的胶体、0.5 mEq的碳酸氢钠及100 U的肝素启动。当CPB开始时，流速可维持150～180 ml/(kg·min)，在降温期间流速减少一半。当颅内温度达到18℃时，开始DHCA，持续45 min后，重新启动CPB，加热大鼠至心包温度34℃，同时逐渐增加流速至150～180 ml/(kg·min)。该方法成功缩小了CPB回路的接触面积，减少预充液容积，从而实现了高效并平价的增强静脉引流模型。

近年来，关于大鼠DHCA模型的研究报道不断增加，但插管位置、设备的选择以及温度的控制仍然是争论的焦点。此外，多数研究仅观察到了DHCA后14 d的神经功能和组织学结果，对于长期存活大鼠模型的恢复时间尚不确定[17]。Liu等[9]成功建立了DHCA的长期存活大鼠模型，并确定了神经系统的恢复时间框架，将24 G血管导管置入左股动脉浅支，以监测血压并分析动脉血气，用20 G导管置入尾动脉，做CPB循环的动脉氧合血灌注，并通过自制的多孔导管置入右颈内静脉，调整到右心房和下腔静脉的位置，以达到满意的静脉引流。整个CPB回路由储血罐、小型氧合器、双滚动泵以及热转换器组成，同时使用加热器/冷却器和热毯，以达到精确的温度控制。CPB持续时间为105 min，在常温CPB阶段的5 min内，流速设定为120 ml/(kg·min)，在降温期间，流量下降一半。每只大鼠在30 min内冷却到直肠温度18℃后，DHCA维持30 min，再将大鼠重新加热至35℃以上，直至CPB停止。通过该模型，成功地在30 min DHCA持续时间后观察到组织病理学缺陷，并确定30 d的恢复时间框架。该模型的成功建立可以进一步探索DHCA术后不良脑结局的机制，并在特定的时间窗内测试新的治疗方法。

3 大鼠DHCA模型的实验指标

3.1 神经及运动功能评估 大鼠的神经功能可以使用已建立的神经评分系统进行标准化的测试。2017年，Chio等[18]采用改良的神经损伤评分对大鼠进行急性神经损伤评估，得分越高，损伤越严重，最高为14分；同时，采用斜面系统和微控制器检测肢体运动功能，倾斜面角度越低，肢体运动功能越小，最大为60°。除了神经学评估外，Morris水迷宫也可以用来评价大鼠神经功能的改变[19]。Morris水迷宫由一个直径1.5 m、深0.3 m的水池和一个隐藏在水面以下(3 cm)的平台组成，平台位于第四象限。在光线昏暗的条件下，将大鼠放置于水中，测量水下平台定位的时间，以测试大鼠神经认知视觉空间学习的记忆的损伤。

3.2 组织学研究 在对大鼠神经和运动功能进行评估后，处死大鼠进行组织学研究。根据需要分别取大鼠肺、肠、脑、肝及肾组织[13]。样品用苏木精和伊红染色，采用Chiu’s法[20]对切片中观察到的组织学改变进行评分，评估组织损伤程度。

3.3 生物化学分析 为了评估肾功能和肝功能，常需要测定血尿素氮、肌酐、天门冬氨酸转氨酶、丙氨酸转氨酶、碱性磷酸酶和乳酸脱氢酶水平[18]。在CPB后采集血液，检测血清中的d-乳酸、肠道脂肪酸结合蛋白和二胺氧化酶水平，以评价DHCA过程中肠道屏障的变化[21]。

3.4 炎症因子和氧化应激指标检测 采用酶联免疫吸附试验检测血清中炎症因子水平，其中以肿瘤坏死因子、白细胞介素-1和白细胞介素-6的关系最为密切[22]。同时，检测大鼠主动脉血中丙二醛、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽的水平，有助于判断DHCA对大鼠氧化应激反应的影响[23-24]。

4 大鼠DHCA模型的应用

近年来，大鼠DHCA模型被广泛应用于临床试验。2014年，Bartels等[25]在一项CPB/DHCA大鼠模型的初步研究中，利用造影剂及MRI技术成功地检测到脑毛细血管通透性增加，证明了使用分子分析结合临床相关成像技术描述CPB/DHCA啮齿动物模型中血脑屏障特征的可行性，为神经功能的测量等研究建立基础。Yu等[26]为了全面了解DHCA手术对体内肾miRNA表达的影响，对大鼠建立了持续60 min的DHCA模型，取肾组织进行微阵列分析，其在DHCA大鼠中发现了异常的肾miRNA表达模式，并进一步讨论了差异表达的miRNA是否与DHCA-AKI发病机制有关。Sgouralis等[27]在大鼠CPB期间，建立数学模型评估尿液氧分压与内髓组织氧分压平衡的程度，从而更好地了解肾中尿液和髓质氧分压之间的关系。Ma等[28]为了探讨一种膜联蛋白a1生物活性肽(ANXA1sp)是否能够解决神经炎症并诱导sirtuin-3调控的细胞保护通路，其在大鼠DHCA模型的基础上，进一步建立新型抽血性心脏骤停引发急性神经炎症的实验模型，并采用紧急保存复苏法，成功地检测ANXA1sp的神经保护作用及其机制。

5 结语

目前，DHCA中引起多种器官功能障碍的机制尚未阐明。建立大鼠DHCA模型不仅可以提高对潜在机制的认识，且可以在推进药物试剂进入临床试验研究前分析其潜在的价值。随着大鼠DHCA模型的不断发展完善，新模型将有助于进一步研究DHCA的病理生理过程，探索中、长期DHCA后多器官功能障碍的机制，并可能在今后的研究中提出新的保护策略。