免疫性血小板减少症患者肠道菌群宏基因组学研究进展

吴 敏， 刘 伶

免疫性血小板减少症(immune thrombocytopenia，ITP)是儿童时期临床最常见的获得性出血性疾病，主要为体液免疫和细胞免疫异常导致的血小板破坏增多和生成减少。ITP的发病机制比较复杂，至今仍未完全被了解。传统观念认为，抗体包被的血小板通过与Fc γ受体的相互作用在脾脏、肝脏或两者中过早地被破坏[1]。自身抗体也可以诱导补体介导或去甲酰化诱导血小板的破坏[2,3]，以及抑制巨核细胞的功能[4]。T细胞的异常愈发受到重视，包括辅助性T细胞(Th)向1型辅助性T(Th1)和17型辅助性T(Th17)表型倾斜[5]，调节性T细胞的数量和功能减少[2,6]，可驱动自身免疫过程。有研究[7]表明CD8细胞也参与其中。因此，免疫异常是其发病的主要原因，全程表现为异常的抗原表达介导的抗体反应、免疫提呈细胞刺激T淋巴细胞、活化的T淋巴细胞激活B淋巴细胞以及补体、单核-巨噬细胞激活、免疫活性细胞凋亡下调等，其中T细胞免疫异常是关键。肠道菌群在免疫调节自稳和免疫耐受中的作用已逐渐明确，并且其失衡在诸多免疫性疾病中起着关键的作用。近年部分研究也发现肠道菌群的失衡可能与ITP的发病也有一定相关性，可以通过恢复肠道菌群平衡作为防治ITP的一种新的策略。该文就ITP患者肠道菌群宏基因组学研究进展进行综述。

1 肠道菌群与免疫性疾病的相关性

肠道菌群的菌体抗原及其代谢产物具有促炎和抗炎双重作用。在小鼠模型中，分段丝状菌(segmented filamentous bacteria,SFB)可上调回肠内急性期血清淀粉样蛋白，促进白细胞介素(interleukin，IL)-6、IL-22的产生，诱导Th17分化，从而促进炎症的发生[8]；此外有研究[9,10]表明脆弱拟杆菌的多糖A和肠道菌群代谢产物短链脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFAs)可导致Treg细胞产生，从而调节炎症反应。因此，肠道菌群失调可能会导致肠道屏障与免疫功能减弱，从而增加免疫性疾病的易感性。在无菌条件下，小鼠模型自身免疫性炎症严重程度明显减弱，且小肠固有层的Th17细胞数量减少。而将SFB引入无菌小鼠后，固有层的Th17细胞可恢复至正常水平，并迅速出现炎症反应样表现[11]，提示SFB可通过促进Th17细胞亚群分化，驱动自身免疫性炎症的发生。另有研究[12]发现某些人类共生的细菌如梭状芽孢杆菌Ⅳ、XⅣa和XⅧ，通过产生SCFAs来抑制组蛋白去乙酰酶抑制剂，从而抑制Tregs的增殖，导致Th17/Treg平衡破坏，最终促进炎症发生。此外肠道菌群失调可出现肠道黏膜屏障的破坏，肠道通透性增加，导致细菌移位及Th17/Treg平衡破坏，导致炎症发生。综上，免疫性疾病患儿肠道菌群的改变可能有着相似的致病原因。肠道微生物相关分子模式(microbiota-associated molecular patterns,MAMPs)是一类由肠道微生物表达的、反映微生物进化水平的分子，包括脂多糖、多糖A、磷壁酸和肽多糖。MAMPs可被树突状细胞、M细胞和肠上皮细胞表面的模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs)识别。PRRs包括Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)、甲酰化肽受体(formylpeptide receptors,FPRs)和核苷酸结合寡聚化结构域样受体(nucleotide binding oligomerization domain like receptors,NLRs)。PRRs作为感受器，跟识别的分子不同，产生不同的效应，包括保护性反应、炎症反应或触发凋亡，因此PRRs在启动固有免疫和适应性免疫、维持肠道内环境稳定、维持黏膜免疫耐受的完整性方面具有重要的作用。肠道大部分微生物具有相同的MAMPs分子，这些分子在人类长期的进化过程中被宿主先天性免疫识别为无害，当做“老朋友”对待，被PRRs识别以后不引起强烈的免疫反应，而仅产生基础信号，使宿主对肠道菌群处于耐受状态或者维持低水平的“生理性炎症”。一方面维持机体免疫系统处于适度的“激活或警觉”状态，如增加树突状细胞(dendritic cells,DCs)表面共刺激分子(CD80、CD83、CD86等)的表达，促进DCs成熟和分泌细胞因子；另一方面调节或抑制机体过度的炎症反应，如诱导产生调节性T细胞和调节细胞因子如IL-10和转化生长因子β(transforming growth factor β,TGF-β)等，从而产生对机体的保护性免疫反应。显然肠道菌群在维持肠道黏膜免疫系统的稳定性方面发挥着重要作用。动物模型提示，肠道共生菌和由他们产生的各种配体在肠道黏膜保护和修复中起到决定性作用，共生菌分泌的脂多糖、脂磷壁酸等，以及代谢产生的丁酸作为TLR的配体，与正常肠道表面的TLR相互作用，产生基础信号。这些信号使得肠上皮细胞耐受损伤的能力增强，获得肠道表面的动态平衡，同时也使肠道表面具有更强的修复能力，保持肠道的健康和微生态的平衡。TLRs作为一组跨膜的PRRs，其在血小板与自身抗体的协同作用在ITP发病机制中的作用受到关注。TLRs通过抗原相关分子模式(pathogen-associated molecule pattern，PAMP)识别细菌和病毒的脂多糖或核酸，激活不同通路传递细胞内信号，致使B淋巴细胞产生如IL、干扰素(interferon,IFN)和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)等炎性细胞因子，激活免疫系统活化抗原呈递细胞，从而产生保护性免疫反应。有益的共生微生物能减少机会性感染的发生，其还能直接或间接地抵御病原菌的定植及增强肠道免疫屏障功能，从而阻止免疫性疾病的发生、发展。

2 肠道菌群与ITP的相关性

TLRs是肠道免疫系统介导识别和杀灭细菌的重要组成部分，同时具有保持对肠道共生菌的耐受性、维持肠道稳态的作用。有研究[13]发现TLRs的表达与拟杆菌、肠杆菌及肠球菌的含量呈正相关，与双歧杆菌和乳杆菌的含量呈负相关。一项对9例ITP患者与10名健康成人的粪便样本进行16S rDNA高通量测序研究[14]也提示ITP患者肠道菌群存在拟杆菌增多，厚壁菌减少的情况。这些研究都提示TLRs的高表达可能与ITP的发生密切相关，免疫性疾病患者肠道菌群失调能够增强肠黏膜中TLRs的表达，介导过度的免疫反应。血小板上表达的TLRs，主要是TLR 4、TLR 7和B淋巴细胞活化因子(B lymphocyte activaion factor,BAFF)。血小板表面TLRs的存在提示这些细胞存在于循环中。感染发生后由于TLRs参与识别感染性抗原从而加速了受体-Fc介导的吞噬作用，导致抗血小板抗体产生和血小板破坏增加[15]。由感染因素触发，TLRs协同发生的血小板破坏可以解释为何一些ITP患者经过抗感染治疗后血小板减少可以获得自限和缓解，而部分患者感染触发因素消失后，免疫紊乱还不能纠正，导致疾病慢性化趋势。研究[16]发现，ITP患者的脾脏B淋巴细胞和循环B淋巴细胞的TLRs及下游细胞因子(包括IL-10和IL-1β)均有上调，说明B淋巴细胞的TLRs在ITP的发病机制中可能有双重作用。有研究表明，Th1/Th2的失衡与ITP的发生有关。Kuwana等[17]在慢性ITP患者中发现GPⅡb/Ⅲa的自体反应性T淋巴细胞。其他研究也支持慢性ITP患者Th1/Th2失衡极化，往往Th1细胞明显上升。Th1细胞释放的细胞因子IL-2、IFN-α、TNF-β参与了Th1、Th2、细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)及巨噬细胞的趋化和血小板破坏。而免疫异常状态的单核细胞也释放TNF，促进了Th1的增加。Th2向Th1转变依赖于多种因素，但细菌刺激有相当的作用。近期有研究[18]证实口腔中的克雷伯杆菌发生异位定植于肠道时，可侵入肠上皮细胞被DCs细胞吞噬，释放IL-6和TNF，促进Th1细胞的炎症反应。此外无菌小鼠的研究证明，肠道正常菌群中属于拟杆菌门的脆弱类杆菌，不仅能够促进脾脏和胸腺的这些外周淋巴组织的细胞和生理的成熟，还能够纠正全身淋巴细胞缺乏，增强分泌IFN-γ的Th1反应。进一步研究证实这个过程是由脆弱类杆菌外膜上的多糖A(polysaccharide A，PSA)完成的，缺乏PSA的类杆菌，则不能诱导T细胞的分化，而纯化的PSA则有和野生脆弱类杆菌相同的作用。PSA被DCs摄取、加工后，与MHCⅡ类分子一起形成MHC-抗原复合物被T细胞表面的抗原特异性受体(T cell receptor,TCR)识别，激活T细胞免疫应答。PSA刺激DCs的TLR2产生IL-12，IL-12与T细胞IL-12受体结合，活化Th1转录子Stat-4，进一步生成IFN-γ。有研究[19]还发现脆弱类杆菌PSA能够诱导肠黏膜固有层以及血液循环CD4+T细胞分化为可分泌IL-10的Treg细胞发挥抑制促炎Th17反应的作用，在精细调节Th17和Treg细胞平衡中具有重要作用。研究表明，慢性ITP患者Th17细胞及其分泌的细胞因子IL-17较对照组明显升高[5]，而成人及儿童ITP患者中均检测到二者升高[20]，提示Th17细胞与ITP患者发病可能相关。研究[21]发现，ITP患者Treg下降，获得治疗后得以回升。其他研究[22]也发现ITP患者Th1、Th17上升和Treg下降。研究[23，24]发现Treg/Th17的比值与ITP的病程多样性及预后相关。此外，有研究[25]表明大剂量地塞米松联合利妥昔单抗治疗ITP可有效提高Treg水平，长期疗效显著优于泼尼松和单纯地塞米松组。因此与Th1、Th17和Treg平衡相关的脆弱类杆菌在ITP发病中的作用值得进一步研究，特别是其是否在慢性、难治性ITP患者中起到作用，有利于提示一种新的了解预后以及进行干预的思路。此外SFB是另一种受到越来越多关注的肠道共生菌。研究[26]表明SFB能够介导小肠中Th17细胞的发育和诱导潘氏结中Th1和Treg细胞水平上升，从而对肠道黏膜免疫发挥广泛的调节作用。也有研究[27]证实,口服假丝酵母菌可以减少自身免疫性疾病患者体内Th17细胞数量，抑制肠道IL-6的产生，并增加调节性T细胞数量，提示膳食酵母可能是通过改变肠道菌群组成对自身免疫性疾病产生有利影响。Smith等[28]发现，肠道微生物所释放的SCFAs能调节RORγt活性，从而调控非致病性与致病性Th17细胞间的平衡。不同的肠道微生物可以刺激Th17细胞产生不同的细胞因子，并发挥相应的功能。

3 宏基因组学在ITP中的应用及展望

肠道菌群可通过其代谢产物及其他特异性的成分激活免疫细胞，如Th17细胞和Treg细胞，诱导其分化方向及分泌功能。而研究[29]证明ITP患者还存在B淋巴细胞的质和量的异常。有研究[30，31]表明自身免疫性疾病患者中Breg细胞受损或数量减少，而从小鼠模型了解到Breg可促进Treg细胞的分化及趋化。因此ITP患者Breg细胞的受损可能导致Treg细胞不能正常的分化，以致抗体介导的T淋巴细胞参与的血小板破坏增多。宏基因组学研究对特定环境中全部微生物的总DNA进行克隆，并通过构建宏基因组文库和筛选等手段获得新的生理活性物质；或者根据rDNA数据库设计引物，通过系统学分析获得该环境中微生物的遗传多样性和分子生态信息。可解释微生物群落多样性、进化关系、种群结构、功能活性及环境之间的相关关系，极大扩展了微生物的研究范围。目前宏基因组学在ITP中的研究常为通过16S rDNA研究ITP患者的肠道菌群多样性，找到其潜在致病菌，但目前各研究的样本量均较少，且缺乏多中心的研究。以后可进行多中心的研究，以确定可能潜在的致病菌，后续通过对相关菌群总DNA进行克隆，明确其具体的分子机制，以便于靶向治疗，及早干预。