非培养检测方法在终末期肝病合并侵袭性真菌感染诊断中的应用

金燕琪 章益民,2

1浙江大学医学院附属第一医院传染病诊治国家重点实验室、国家感染性疾病临床医学研究中心、国家传染病医学中心、感染性疾病诊治协同创新中心，杭州310003；2浙江大学医学院附属第一医院海宁院区(海宁市人民医院)感染病科，浙江嘉兴314400

终末期肝病（ESLD）指各种慢性肝脏损害所致的肝病晚期阶段，主要表现为肝功能严重受损和失代偿[1]，包括慢加急性肝衰竭（ACLF）、肝硬化急性失代偿（ADLC）、慢性肝衰竭（CLF）和晚期肝细胞癌。由于抗菌药物使用频率高、住院次数多和使用侵入性治疗等因素，ESLD患者侵袭性真菌感染（IFI）已经构成其治疗失败乃至死亡的重要原因[2-3]。IFI指真菌侵入人体组织、血液，并生长繁殖引起炎症反应、组织损害乃至器官功能障碍的病理改变过程，包括深部真菌感染（无菌部位）及真菌血症[4]。由于缺乏具体体征和症状，真菌培养具有阳性率低以及培养周期时间长等缺点，ESLD合并IFI的早期、精准的诊断通常具有挑战性。非培养检测方法如直接显微镜镜检（包括真菌荧光染色）、血清学检测方法及分子生物学方法已成为ESLD合并IFI具有发展前景的早期检测手段。

一、ESLD合并IFI的流行病学

根据多项研究，IFI在ESLD患者中的发生率约为15%[3，5]，HBV相关ACLF中的IFI发病率较高（47.6%）[6]。在ESLD患者中，侵袭性念珠菌病（IC）是主要的IFI，发生率约为64.1%；其次是侵袭性曲霉病（IA），发生率约为35.8%[5]。对于不同的免疫功能异常，IFI的病原体有所不同[7]，念珠菌往往和患者的黏膜屏障破坏以及真菌的定植密切相关；曲霉菌往往和细胞免疫功能异常相关，尤其是粒细胞减少或缺乏的患者。ESLD患者往往同时存在黏膜屏障的异常和粒细胞减少，因此临床上IC和IA均常见。ESLD合并IFI最常见的部位是呼吸道和泌尿道，其次是胃肠道、血流、脑部和自发性真菌性腹膜炎[5-6，8]。3个月内使用抗生素、肾衰竭、糖尿病、更高的终末期肝病模型（MELD）评分以及脑或呼吸器官衰竭等是IFI发展的独立危险因素[3，5]。ESLD患者发生IFI时表现往往隐匿、不特异。在一项大样本、多中心的研究中，肝硬化患者发生IC时，仅60%患者表现为发热[9]。合并IFI的ESLD患者死亡率（57%～77%）显著高于未合并的患者（14%～20%）[3，5-6，10-13]。

二、IFI的非培养检测方法

1.直接显微镜镜检

样本直接涂片具有操作简便，检测快速等优点[14]。欧洲癌症研究和治疗组织/侵袭性真菌感染协作组和美国国立变态反应和感染病研究院真菌病研究组（EORTC/MSG）侵袭性真菌病专家指南2020修订版[以下简称“EORTC/MSG指南（2020年版）”][4]提出将通过针吸或活检组织获得的样本，经直接显微镜检查，发现菌丝或黑色酵母样形态伴有相关组织损伤的证据可作为诊断丝状真菌的证据：隐球菌是否有出芽，念珠菌是否有假菌丝或真菌丝作为诊断酵母菌感染的诊断依据。对于疑似丝状真菌感染，样本推荐使用痰液、支气管肺泡灌洗液（BALF）、支气管刷片或抽吸液，显微镜镜检下如有真菌成分提示丝状真菌。有研究通过显微镜直接观察IA患者的肺活检组织，发现曲霉菌的形态表现为透明和分隔的双分枝菌丝，分枝呈45°且宽度均匀[15]。由于样本直接涂片镜检在有菌部位只有发现大量菌丝才具有诊断意义，并且样本取材的好坏直接影响结果，因而阳性率很低，不能将真菌鉴定到种的水平[16-17]，因此阴性结果不能排除感染。

钙荧光白（CFW）是一种非特异性荧光染色剂，可以和真菌细胞壁的几丁质、纤维素和其他含有β-（1，4）-糖苷键的碳水化合物紧密结合[18]。CFW吸收紫外光后发出明亮的荧光，真菌轮廓和黑暗的背景在荧光显微镜下对比明显[19]，可以提高IFI阳性诊断率。

2.血清学检测方法

（1）（1,3）-β-D葡聚糖检测（G试验）

G试验适用于除隐球菌和接合菌（包括毛霉菌和根霉菌等）外所有深部真菌感染的早期诊断，尤其是念珠菌和曲霉菌[20]。EORTC/MSG指南（2020版）[4]提出在适当的临床环境中，包括伴和不伴中性粒细胞减少的血液系统恶性肿瘤、造血干细胞移植后中性粒细胞减少的患者，以及由于胃肠道手术而反复发生吻合口漏，上消化道穿孔的IC风险较高（＞10%）的ICU患者或有临床怀疑感染的坏死性胰腺炎患者，2次或多次≥80 ng/L的血清G试验水平可用于诊断IFI[21-22]，同时建议使用Fungitell检验的单一阈值（＞80 ng/L）。多项血清G试验IFI的检测荟萃分析研究中，G试验对IC的敏感性和特异性分别为65%～85%和75%～85%，对IA的敏感性和特异性分别为71%～82%和82%～85%[22-23]。在对IFI检测中，G试验灵敏度和特异性都很好，且G试验检测样本采集方便，检测时间短，可作为早期诊断的依据，但G试验的不足之处在于其不能区分真菌种属，不能诊断接合菌和隐球菌。

（2）半乳甘露聚糖（GM）试验

GM是曲霉菌特有的细胞壁多糖成分，可用于IA的早期诊断[24]。曲霉菌检测广泛使用Bio-Rad曲霉菌抗原检测试剂盒（Platelia Aspergillus Ag）[25]。曲霉菌感染时，GM的释放量与菌量呈正比，可以反映感染的严重程度，动态监测血清GM水平可反映治疗的效果。EORTC/MSG指南（2020版）[4]将GM试验作为IA诊断标准的真菌学证据之一，即单一血清GM试验（≥1.0）或BALF-GM试验（≥1.0）或血清GM试验（≥0.7）合并BALF-GM试验（≥0.8），脑脊液GM试验（≥1.0）即可作为诊断依据。根据多项GM试验在IA诊断中应用的研究发现，GM试验的特异性和敏感性分别为73%～90%和72%～90%[26-27]。

3.分子生物学方法

（1）聚合酶链反应（PCR）

应用PCR技术可快速、特异地检测真菌感染患者各种临床样本，如血液、BALF及组织样本等。EORTC/MSG指南（2020版）[4]提出，PCR具有检测曲霉菌种属的独特能力，曲霉菌PCR检测是筛选和确认可疑IA的检测方法。对于疑似IFI患者，该指南将符合“连续2次或以上血浆，血清或全血样本PCR试验阳性；BALF样本2次或多次重复PCR试验阳性；至少1次PCR试验在血液样本及1次PCR试验在BALF样本中阳性”其中之一条纳入确诊IA的标准[4]。对于活检组织中发现菌丝阳性的患者，指南中推荐PCR结合DNA测序扩增真菌DNA。此外，已有研究表明PCR能够直接从临床样本中鉴定与三唑抗真菌药物耐药相关的某些突变[28]。因此，PCR检测在IFI疑似患者中具有快速、准确诊断的价值，同时对培养阴性的样本具有补充诊断的意义。然而，由于不同实验室使用的引物、反应条件及仪器不同，不同研究PCR诊断IFI的敏感度和特异性相差较大。PCR只能检测已知的特定病原体，难以用于未知微生物的检测，是诊断IFI的最大障碍。

（2）二代测序（NGS）

NGS可鉴定出样本中所含核酸的种类，并对病原体的序列数、覆盖度等进行定量分析，为疑难危重感染提供精准快速的诊断依据。NGS检测具有无偏倚性、覆盖广和快速等优点，补充了传统病原学诊断的不足，有极大的临床应用前景。Shishido等[29]使用游离DNA-NGS技术检测1例中枢神经IA肝移植患者的血清样本，结果提示曲霉菌阳性。在1例疑似IFI的皮肌炎患者诊断中，NGS技术检测BALF提示存在杰氏肺囊虫、烟曲霉菌、米根霉菌3种真菌，且根据NGS结果调整抗真菌治疗后患者症状得到显著改善[30]。在一项基于扩增子的NGS技术鉴定真菌染色阳性的福尔马林固定石蜡包埋织病原体的研究中，NGS检测44份来自35例IFI患者的样本，检测到了54种真菌病原体，其中包括40种丝状真菌，10种酵母菌以及4种双相真菌，该检测结果与病理结果完全一致[31]。

三、非培养检测方法对ELSD合并IFI诊断的价值

1.G试验

一项对264例ACLF患者的回顾性分析研究中，Verma等[5]首次评估了G试验在ACLF合并IFI高危患者早期诊断中的作用。该研究发现，在ACLF患者中，G试验（80 ng/L）诊断IFI的灵敏度和特异性分别为97.4%和60.0%。此外，G试验水平及其阳性有可能作为ACLF合并IFI高死亡率的预测指标。因此，在ESLD疑似合并IFI的临床环境中，G试验能提供较高的早期诊断价值，但同时亟待更多的研究为其诊断价值提供充足的临床证据。

2.GM试验

Verma等[5]评估了GM试验在ACLF患者中诊断临床可疑IFI的价值，其特异性可达100%。在一项描述了3例肝硬化急性失代偿合并IA的病例系列报道中，有2例患者呈血清GM阳性，而3例BLAF-GM均呈阳性[32]。Falcone等[33]描述了2例ESLD合并IA的病例系列报道，GM试验在痰液中均表现为阳性而在血清中均表现为阴性。因此在ESLD患者中，GM试验阳性对IA有较高的诊断特异性。同时，在IA血清学证据尚不足并且能获得呼吸道样本的临床环境下，呼吸道样本的GM实验阳性对ESLD患者合并IA有较强的早期诊断价值。

3.PCR

一项在46例ESLD患者中筛选合并IFI及评估其危险因素的研究中，12例患者确诊合并IFI，PCR检测出13个样本（6个腹水样本和7个血液样本）真菌DNA阳性，12例传统培养阴性的ESLD患者中有3例的PCR结果为阳性[3]。因此，PCR检测在ESLD患者疑似合并IFI需要确诊时具有快速、准确的意义，同时对培养阴性的样本具有补充诊断价值。

四、结语和展望

各种非培养检测方法在ESLD合并IFI的诊断中各有优点，但也有其局限性，如何将这些方法合理、综合的应用需要进一步的研究。在一项涉及125例IFI高危患者的临床研究中，作者在血清样本中通过组合使用曲霉菌PCR及GM试验评估了非培养检测方法在IFI中的诊断价值[34]，实现了较高的敏感性（98.2%）和特异性（89.3%），这种思路也可以在ESLD合并IFI的诊断中借鉴。随着对病原体早期诊断和精准诊断要求的提高，亟待更多的以NGS为代表的分子生物学方法在ESLD合并IFI中的广泛应用。另外，随着非培养检测方法在ESLD合并IFI诊断中的深入应用，对不同年龄、ESLD亚型、真菌类型、感染部位IFI数据的不断增加，循证医学证据级别可望获得显著提升。期望在不久的将来，非培养检测方法在ESLD合并IFI诊断中的应用获得广泛共识，形成清晰的路线图。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突