华蟾素片对CT26结肠腺癌诱导恶病质小鼠肌肉萎缩的影响

林毅，王振飞，肖静

福建中医药大学附属人民医院肛肠三科，福建福州350004

进行性骨骼肌流失与消耗是癌性恶病质(cancer cachexia，CC)最典型、最复杂的特征[1]。它常常导致患者的体重下降、活动能力减退等，最终导致免疫功能低下，治疗耐受力下降，缩短了总生存时间[2]。研究表明，肿瘤诱导的肌蛋白降解密切相关的是泛素蛋白连接酶E3，而其中最重要的标记物是肌萎缩F-box蛋白(muscle atrophy F-box，MAFbx)和肌肉环指蛋白-1(muscle ring finger 1，MuRF-1)[3]。该实验建立CT26结肠腺癌诱导的恶病质小鼠模型，在华蟾素片干预与否下，检测和对比净体质量、心肌、腓肠肌和附睾脂肪的质量、腓肠肌组织中MAFbx、MuRF-1 mRNA的表达[4]，来探讨华蟾素片对恶性肿瘤恶病质引起的骨骼肌萎缩的治疗价值，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物与模型建立

清洁级雄性健康小鼠24只，6～8周龄，体重18～22 g。小鼠CT26腺癌细胞经培养媒介（10%小牛血清、1%青霉素、100μg/mL链霉素组成）培养，每3～4天传代1次，3代后收集，经磷酸盐缓冲液冲洗（PBS），制成含肿瘤细胞的混悬液。将5×106(0.2 mL PBS)个细胞接种于16只小鼠前腋窝皮下。

1.2 药物、试剂与仪器

华蟾素片（国药准字Z34020272）。MAFbx(AB3353，1 mg/mL)，MuRf-1(RS1328R，1 mg/mL)；Trizol试剂盒(LGTZ001）。RT-PCR试剂盒(No.121256)。仪器：2720 PCR扩增仪；蛋白电泳仪，DYCZ-26B。

1.3 动物模型建立、分组与给药

24只小鼠按照随机数字表法分为3组：正常组（NN）、单纯恶病质组（CC）、实验组（EG），每组8只。待动物模型建立成功后，实验组予以药物干预：华蟾素片3 g/L溶于生理盐水中，每只实验组小鼠灌喂量为0.1 mL/g，正常组及单纯恶病质组灌喂等量生理盐水，2次/d，连续灌喂14 d。

1.4 观察指标

观察小鼠进入恶病质状态的表征，实验前后记录每只小鼠的净体质量（总体质量减去肿瘤质量），检测实验后每只小鼠心脏、腓肠肌、附睾脂肪的质量。RTPCR法检测MAFbx、MuRF-1 mRNA表达：Trizol法提取小鼠腓肠肌RNA；采用β-actin基因，经数据库获得基因序列，采用Primer-Expression软件辅助设计[5]。

1.5 统计方法

采用SPSS 18.0统计学软件分析数据，计量资料用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 净体质量变化及心肌、骨骼肌、附睾脂肪比较

实验前后的净体质量对比,单纯恶病质组与实验组均显著下降，差异有统计学意义(t=5.394、2.832，P＜0.05)；两组对比，单纯恶病质组小鼠净体质量的下降更加明显，差异有统计学意义(t=4.055，P＜0.05)。见表1。

表1 两组小鼠净体质量比较[（±s），g]

表1 两组小鼠净体质量比较[（±s），g]

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实验后骨骼肌、心肌及附睾脂肪的质量的对比，恶病质组小鼠的下降更加明显，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表2。

表2 两组小鼠骨骼肌、心肌及附睾脂肪的质量的比较[（±s），g]

表2 两组小鼠骨骼肌、心肌及附睾脂肪的质量的比较[（±s），g]

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2.2 腓肠肌组织MAFbx、MuRF-1 mRNA表达

与正常组比较，单纯恶病质组、实验组小鼠腓肠肌中MAFbx、MuRF-1 mRNA表达量显著升高，差异有统计学意义(P＜0.05)；但与单纯恶病质组比较，实验组小鼠腓肠肌中MAFbx、MuRF-1 mRNA的表达量均显著降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表3。

表3 两组小鼠腓肠肌组织MAFbx、MuRF-1 mRNA表达比较[（±s），g]

表3 两组小鼠腓肠肌组织MAFbx、MuRF-1 mRNA表达比较[（±s），g]

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3 讨论

恶性肿瘤已成为威胁全人类生命及健康的最重要疾病之一。到2035年，罹患恶性肿瘤的人数将增至2 400万，将成为全球最大的公共卫生问题[6]。恶性肿瘤发展到中晚期，常伴发肿瘤诱导的恶病质，据统计，约有50%的晚期和约80%的终末期患者会出现该症状，约22%的癌症患者的直接死因是恶病质，而不是肿瘤本身[7]。国际恶病质大会对此达成了共识：它是多种因素介导的机体骨骼肌质量持续性下降，伴或不伴有脂肪质量的下降，并因此导致多器官功能障碍直至衰竭的临床综合征[8]。

经过近些年的研究认为，癌性恶病质导致骨骼肌质量与体重的下降，有至少3条独立的途径：①溶酶体蛋白酶系统途径；②钙依赖的蛋白酶系统途径；③ATP-泛素-蛋白酶体途径。其中，泛素-蛋白酶体降解途径（UPP途径）是其重要途径，它由泛素(Ub)、泛素相关酶（活化酶E1、耦联酶E2、蛋白连接酶E3）和蛋白酶体三部分组成。泛素蛋白连接酶E3是途径激活的关键酶，经过催化形成降解信号，使蛋白酶体识别靶蛋白，产生骨骼肌降解。并且它决定了该途径的特异性和降解速率[9]。MAFbx、MuRF-l是蛋白连接酶E3的重要组分，特异性表达在骨骼肌细胞。在肌萎缩的发生发展过程中被显著激活，使底物蛋白泛素化，加速肌蛋白被转运后在蛋白酶体中降解，产生进行性的肌萎缩。在该基因去除的实验动物体内，肌肉萎缩的发生率下降。因此，MAFbx和MuRF-l基因被认为可能是控制骨骼肌蛋白分解的正调节关键基因[10]。

近年来，中医药在治疗恶性肿瘤的基础研究和临床实验中均取得重大的进展。中医认为癌性恶病质系因癌肿久病，从而耗伤人体的阴、阳、气、血所致，中医药治疗可以达到清热解毒、活血化瘀、软坚散结的作用。尤其在中晚期恶性肿瘤的治疗中，起到了增效减毒、提高机体免疫力、抑制肿瘤生长、改善临床症状、提高生活质量的作用[11]。华蟾素是由中华大蟾蜍的皮，经多道工序制成的口服中成药，它的有效生物活性成分为吲哚生物碱和甾体强心苷等[12]。该成分可提高树突状细胞表面分子的表达水平，影响IL-6、TNF-α等细胞因子的分泌，因而增强其抗原呈递功能，抑制诱导肿瘤细胞凋亡，提高免疫力，减缓癌性恶病质的进展，因而华蟾素被广泛应用于恶性肿瘤的临床辅助治疗[13-14]。

在临床中，谢明智等[15]发现华蟾素在肝癌引起的癌性恶病质的治疗中，可明显改善患者的营养状况。为进一步论证华蟾素在大肠癌恶病质治疗中效果，该实验通过建立癌性恶病质的动物模型，在华蟾素片的灌喂干预下，实验组小鼠质量由（19.98±1.08）g下降至（18.86±0.63）g，而单纯恶病质组小鼠的体重由（20.10±1.21）g下降至（17.39±0.75）g，尽管两组小鼠质量均显著下降(t=5.394、2.832，P＜0.05)。但两组比较发现，单纯恶病质组小鼠净体质量的下降更加明显(t=4.055，P＜0.05)。为了更加确切地辨别骨骼肌组织的变化，统计了实验后心肌组织的质量分别为单纯恶病质组（113.08±12.23）mg、实验组（133.04±11.57）mg；腓肠肌组织的质量分别为单性恶病质组（228.84±16.22）mg、实验组（248.12±10.93）mg；附睾脂肪组织的质量分别为单纯恶病质组（425.90±17.25）mg、实验组（462.67±28.38）mg，三类指标的比较发现，在华蟾素的干预下，小鼠机体中重要肌肉组织的萎缩明显改善(t=3.352、2.788、3.131，P＜0.05)。同样，在实验后的腓肠肌组织中MAFbx、MuRF-1 mRNA表达的对比中可以得到相同的结论，华蟾素能明显缓解和改善大肠癌癌性恶病质小鼠的骨骼肌和重要脏器的肌肉萎缩程度，为进一步的临床实践提供了动物实验基础。