微生物菌剂拌土对玉米农田土壤细菌群落多样性的影响

沙月霞 王晨曦 邢敏 王佳娟 李明洋 沈瑞清

摘要 为明确微生物菌剂拌土对玉米农田土壤细菌群落多样性的影响。对玉米农田土壤细菌的总DNA提取后，采用微生物多样性测序技术对玉米农田土壤细菌的16S rRNA基因进行了序列测定，分析了2种微生物菌剂拌土后玉米农田土壤细菌群落多样性和结构特征。微生物菌剂M1和M2拌土增加玉米农田土壤中全磷、硝态氮、有效磷和速效钾的含量;对玉米土壤细菌群落多样性有一定程度的影响，丰富度增加，多样性和均匀度降低，检测样本序列数量和细菌群落的OTU （operational taxonomic units）數量显著增加;对土壤细菌群落组成有影响，变形菌门（Proteobacteria）的丰度下降，放线菌门（Actinobacteria）和厚壁菌门（Firmicutes）的丰度增加，优势菌属放线菌和芽孢杆菌的丰度增加;降低了土壤中引起人类疾病、参与细胞转化的微生物丰度，增加了参与代谢通路的微生物丰度。微生物菌剂拌土会影响玉米农田土壤细菌群落多样性和结构组成，改善土壤营养，增加有益微生物的丰度，进而改善玉米农田生态环境。

关键词 多样性;土壤细菌群落;微生物菌剂;高通量测序;微生物生态学

中图分类号 S 154.3文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2021）05-0138-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.05.039

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Effect of Clay Treated by Microbial Agents on Soil Bacterial Community Diversity of Maize Field

SHA Yue-xia1，WANG Chen-xi2，XING Min1 et al

（1. Institute of Plant Protection，Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Yinchuan，Ningxia 750011;2. School of Life Science，Ningxia University，Yinchuan，Ningxia 750004）

Abstract To understand the microbial diversity of soil bacterial community of maize field treated by microbial agents on clay.High-throughput sequencing technology was adopted to study the microbial community structure and composition of soil bacteria in maize field.DNA of the microbial community of soil bacteria in the maize field was extracted. The bacterial 16S rRNA gene hypervariable region V5-V7 was detected by high-through sequenceing technologies.The contents of soil physicochemical indexes including total phosphorus，nitrate nitrogen，available phosphorus，rapidly available potassium was increased after maize field treated by microbial M1 and M2 on clay，respectively.In addition，the soil bacterial community diversity of maize field was influenced in some random，richness index was higher，diverse and evenness index were lower，and sequence and operational taxonomic units number of samples were increased. The abundance of Proteobacteria was reduced，and the abundance of Actinobacteria and Firmicutes were increased. Whats more，the abundance of the dominant bacteria genus containing Actinomycetes and Bacillus were improved evidently. The abundance of soil bacteria which could cause human disease and participate cell transformation was reduced，and that of soil bacteria participating metabolic pathway was higher. The soil bacterial community diversity and structure could be influenced after maize field treated by microbial agents on clay，in addition to enhance soil nutrition，increase abundance of beneficial microorganism，and then improve the ecological environment of maize field.

Key words Diversity;Soil bacterial community;Microbial agent;High-throughput sequencing technology;Microbial ecology

土壤微生物参与土壤物质循环和能量流动，是土壤有机物质的重要分解者和对农田土壤生态环境至关重要的生物活性因子，对环境影响非常敏感[1]。土壤微生物群落是土壤生态系统的重要组成部分，是衡量和评价土壤质量的指标之一[2-3]。土壤微生物群落多样性、丰富度与均匀度可以保证土壤生态环境的稳定性，提高土壤抵抗环境恶化的缓冲能力[4-5]。开展黄河灌区土壤微生物群落多样性和结构研究，对于实现黄河流域生态系统可持续发展具有重要的生态意义。

玉米是重要的粮食作物、饲料作物和工业原料，由于种植模式、气候变化、化学肥料与农药、土壤盐渍化以及干旱等因素的影响，玉米农田土壤中病原菌的数量日积月累，土传病害的危害日益加重[6-7]。土壤微生物中病原菌的数量和活性对农业生产中的农艺措施或者生物制剂的投入响应敏感[8-9]。微生物菌剂施用能够改善土壤的营养状况，提高土壤养分，还可以调节土壤微生物群落结构及多样性[10]。Chen等[11]采用棘孢木霉菌（Trichoderma asperellum）颗粒剂在播种前与化肥混合施入土壤，对玉米茎腐病防效显著。

冯帅[12]研究发现接种施氏假单孢菌（Pseudomonas stutzeri）A1501 能够显著影响玉米根际土壤细菌群落和固氮菌群落结构。程扬等[13]研究发现土壤中施加 5 t/hm2的秸秆生物炭对玉米根际和非根际土壤微生物群落结构和生态功能影响显著，主要影响微生物群落代谢、遗传和信息传递等过程。已有的研究主要集中于木霉菌、假单孢菌等对玉米田土壤细菌群落结构的影响，芽孢杆菌为功能菌的复合微生物菌剂对玉米农田土壤细菌群落多样性的研究较少。该研究不仅探索了芽孢杆菌为功能菌的复合微生物菌剂拌土对玉米农田土壤细菌群落结构的影响，还探索了复合微生物菌剂对土壤营养的改善效果。笔者采用高通量测序技术，研究微生物菌剂拌土对宁夏玉米农田土壤细菌群落的物种组成、群落多样性及结构的影响，为进一步探讨土传病害的防控与农田土壤的微生态功能研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验地点是宁夏回族自治区石嘴山市惠农区庙台乡（106.70° E，39.20° N）。土壤类型为潮土，地下水位较高，盐碱较重，有机质平均含量为（16.70±3.77） g/kg，有效磷平均含量为（26.70±17.30） mg/kg，速效钾平均含量为（199.90±66.87） mg/kg。

1.2 试验材料

①微生物菌剂M1，包括枯草芽孢杆菌（B. subtilis）HR15、萎缩芽孢杆菌（B. atrophaeus）HR37和贝莱斯芽孢杆菌（B. velezensis）HR55按照1∶1∶1比例的混合发酵液15 L、腐殖酸2.75 kg、硫酸钙160 g[14]、硫酸鋅80 g[15]、硫酸亚铁80 g、硫酸钾80 g[16]，载体分别为羊粪30 kg。②微生物菌剂M2，将M1的载体更换为鸡粪有机肥（包含有机碳25.5%、氮1.63%、磷1.54%、钾0.85%）约30 kg。③微生物菌剂对照MCK，其功能菌是枯草芽孢杆菌和酵素菌BYM（由细菌、放线菌和真菌三大类30多种有益菌和生物酶组成的功能团），枯草芽孢杆菌≥1亿个芽孢/g，酵菌素≥5亿/g，由雷邦斯生物技术（北京）有限公司，载体是水溶性腐殖酸≥55%。④化学农药对照是20%噁霉灵可湿性粉剂+生根粉，由深圳诺普信农化股份有限公司生产。玉米品种是济玉901号。

1.3 微生物菌剂田间拌土的方法

2019年4月11日在宁夏回族自治区惠农区庙台乡东永固村种植玉米（未用过种衣剂），种植前将微生物菌剂M1、M2、微生物对照药剂（MCK）均匀撒施在农田土壤表面，施用量为600 kg/hm2，20%噁霉灵可湿性粉剂+生根粉混合液（ES）均匀喷施到土壤表面，所有试验小区均使用旋耕机旋耕，旋耕深度为20 cm左右。田间试验设计5个处理：CK是空白对照;M1是载体为羊粪的微生物菌剂M1;M2是载体为鸡粪有机肥的微生物菌剂M2;ES是化学农药对照[20%噁霉灵可湿性粉剂+生根粉（4～6 g/m2）];MCK是微生物菌剂对照。每个试验小区面积是200 m2，小区随机排列，小区之间用田埂分隔，每个处理4个重复。试验期间不施用其他杀菌剂，正常进行杀虫剂、农艺措施和水肥管理。

1.4 微生物菌剂拌土对玉米农田土壤理化性质的影响

玉米乳熟期（7月22日）采用取土器（直径为6 cm，长度为20 cm）采集农田土壤（距离植株15 cm，深度为0～20 cm），土壤样本采用干冰带回实验室，一部分土壤样品送上海美吉桑格生物医药有限公司检测土壤微生物群落多样性，另一部分土壤样本检测土壤pH、有机碳、有机质、全氮、全磷、硝态氮、有效磷、速效钾等理化指标。

土壤样品基本理化参数（全氮、全磷、pH 等） 采用常规方法测定：土壤pH采用ZLJC/YQ-025型pH计测定，全氮采用凯氏定氮法测定，有效磷采用碳酸氢钠浸提-钼锑抗比法测定，全磷采用碱熔法测定，速效钾采用乙酸铵浸提-火焰光度法测定，土壤有机质采用重铬酸钾容量法-外加热法测定，土壤硝态氮采用紫外分光光度法测定。每个样品3个重复，数据为平均值±标准误。

1.5 基因组DNA抽提 提取各个处理的土壤样本基因组总DNA，然后利用1%琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA。

1.6 PCR扩增

细菌扩增引物为338F：5′-barcode-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′，806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′，对细菌16S rRNA基因V3～V4可变区进行PCR扩增，引物由上海美吉生物医药科技有限公司设计合成，测序区域合成带有barcode的特异引物。PCR正式试验采用20 μL反应体系：10×PCR Buffer 2.0 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2.0 μL，5.0 μmol/L正向引物0.8 μL，5.0 μmol/L反向引物0.8 μL，rTaq Polymerase 0.2 μL，BSA 0.2 μL，Template DNA10 ng，补ddH 2O至20 μL。PCR扩增条件：95 ℃ 3 min;循环数×（95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s）;72 ℃ 10 min，10 ℃直到反应结束。第一轮扩增引物：799F-1392R 27cycles，退火55 ℃。第二轮扩增引物：799F-1193R 13 cycles，退火55 ℃。

对第二轮PCR扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收PCR产物，Tris-HCl洗脱;2%琼脂糖电泳检测。将PCR产物用QuantiFluorTM -ST蓝色荧光定量系统（Promega公司）进行检测定量，之后进行相应比例的混合。混合后的产物用Illumina公司的Miseq 2×300平台测序。

1.7 数据处理与分析

高通量测序得到的原始数据进行质量控制和软件拼接，过滤掉低质量的序列。将有效序列相似性≥97%序列聚类成为分类单元 （operational taxonomic units）。运用R软件进行OUT分类等级的相对丰度统计，再用QIIME软件进行单样品组成分析，计算样品的Coverage、Chao、Shannon指数等[14-16]。Shannoneven值数值越大，说明群落均匀度越低。Shannon值越大，说明群落多样性越高。Coverage是覆盖度指数，表征微生物样本序列的检测概率，数值越高表明检测出的序列概率越高，能够反映样本中微生物的真实情况。Chao为丰富度指数，数值越大丰富度越高。利用QIIME和和Ggplot 2 软件进行PCoA分析，ANOSIM中的statistic（R=-1～+1）越接近于1表示各处理组之间的差异大于组内的差异，如果R值比较小表示处理组之间和组内没有差异。P值如果小于0.05，说明检测值的可信度较高。通过Tax4Fun软件对16S RNA基因序列进行基于Silva数据库的KEGG功能注释。

统计分析采用DPS 17.10软件，显著性分析采用单因素方差分析中的最小极差法（least significant ranges，LSD）（P≤0.05），数值为3次重复的平均值±标准误。

2 结果与分析

2.1 微生物菌剂拌土对玉米农田土壤理化性质的影响

微生物菌剂拌土对玉米农田土壤理化性质的影响见表1。由表1可知，与空白对照相比，4组处理均可以增加土壤中有机碳和有机质含量，对玉米农田土壤其他营养指标影响趋势不一致。微生物菌剂M2可以增加土壤中全氮、全磷、硝态氮、有效磷和速效钾的含量，微生物菌剂M1增加土壤中全磷、硝态氮、有效磷和速效钾的含量，噁霉灵可湿性粉剂ES处理组降低土壤中硝态氮、全氮和速效钾的含量，增加全磷和有效磷含量。

安徽农业科学2021年

2.2 检测样本序列统计 对5个处理的15个样本进行了16S rRNA基因测序分析，原始数据经过拼接和过滤后得到797 948条优质序列。不同拌土处理获得不同的序列数量，M2（59 237）>MCK（54 503）>M1（53 611）>CK（50 464）>ES（48 168）。一般将相似水平在97%的序列进行OTU聚类，统计所有样本OTUs的丰度信息。检测样本优质序列的长度主要分布在401～440 bp，其中在401～420 bp序列数量最多为465 960條（图1）。

2.3 玉米农田土壤细菌群落的共有和独有OTU

Venn图一般可以比较不同检测样本中共有和独有的OTU数目。图2显示，5个处理样本中的OTU数量不同，MCK（4 695）>M1（4 653）>M2（4 396）>ES（4 238）>CK（4 351）。不同处理组的土壤细菌群落中既有共有OTU物种，也有独有的OTU。5个处理相同的OTU有2 701个，M1处理组独有的OTU数量为266个，M2处理组独有OTU数量为209个，MCK处理组独有OTU数量为412个，CK处理组独有OTU数量为208个，ES处理组独有OTU数量为166个。除共有和独有OTU外，各处理之间有相同或相似的OTU。

2.4 丰度等级曲线

Rank-Abundance曲线用以分析细菌群落的物种丰富度和均匀度，曲线的宽度反映了物种的丰富度，宽度范围越大，丰富度就越高;曲线的形状反映了群落均匀度，曲线越平缓，均匀度越高;曲线的下降趋势反映了物种的多样性，下降趋势越平滑则物种多样性越高，下降趋势快速陡然表明物种的多样性较低，群落中的优势菌群所占比例较高。

图3显示，微生物菌剂M1和M2样本的曲线跨度最大，且重合多，其他样本的曲线跨度较小，说明M1和M2样本的丰富度最高，而噁霉灵可湿性粉剂、微生物菌剂对照和空白对照样本的丰富度较低。5组样本的曲线形状平缓、下降缓慢，表明5组处理的群落多样性和均匀度都较高，其中空白对照CK的曲线下降相对剧烈，说明空白对照的群落多样性和均匀度低于其他样本。丰度等级曲线说明微生物菌剂拌土对土壤细菌群落的丰富度、多样性和均匀度有影响。

2.5 微生物菌剂拌土对玉米农田土壤细菌群落多样性的影响

2.5.1 Alpha多样性。采用16S rRNA基因测序技术对玉米农田土壤细菌群落多样性进行了分析，明确微生物菌剂拌土对玉米田土壤细菌群落多样性的影响，微生物菌剂拌土对玉米农田土壤细菌群落多样性的影响见表2。由表2可知，检测样本的覆盖度均达98%以上，说明检测结果基本反映了土壤样本中细菌群落多样性信息。各处理的土壤细菌群落丰富度指数有一定差异（P<0.05），M1>M2>CK≈MCK≈ES。微生物菌剂拌土后降低了土壤细菌群落多样性，各处理之间有一定差异（P<0.05），CK>M1≈MCK≈ES>M2。微生物菌剂拌土对土壤细菌均匀度有一定影响（P<0.05），CK≈ES≈MCK>M1>M2。试验结果证实，微生物菌剂拌土对玉米农田土壤细菌群落多样性具有一定程度的影响。

2.5.2 Beta多样性。采用主坐标分析（principal co-ordinates analysis，PCoA分析）比较不同处理微生物群落差异。土壤细菌群落PCoA（图4）的前2个主坐标轴解释了41.99%的群落差异，其中轴Ⅰ和轴Ⅱ分别是27.62%和14.37%，微生物菌剂对照MCK和M2分布在不同象限，与空白对照CK相距较远，说明微生物对照菌剂和M2拌土会改变土壤细菌群落结构。微生物菌剂M1、噁霉灵可湿性粉剂（ES）处理组和空白对照的土壤细菌群落距离较近，说明这2组处理对玉米农田土壤细菌群落多样性有一定程度的影响，但还可能存在其他影响因素。样本分组相似性分析（analysis of similarities，ANOSIM）结果显示，5组样本之间的R值只有0.262 2，说明处理组间差异与组内差异之间没有差异（P>0.05）。P值为0.015说明该检测结果可信度比较高，能够显示组间和组内的差异。

2.6 微生物菌剂拌土对玉米农田土壤细菌群落结构组成的影响

2.6.1 门水平上的群落构成。图5显示玉米农田土壤中的细菌门主要包含变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、绿弯菌门（Chioroflexi）、 酸杆菌门（Acidobacteria）、芽单孢菌门（Gemmatimonadetes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）。拌土处理组样本的放线菌门、酸杆菌门和厚壁菌门的相对丰度高于空白对照，其中微生物菌剂M1和M2的放线菌门、厚壁菌门和拟杆菌门的丰度最高。空白对照样本的变形菌门和芽单孢菌门相对丰度高于其他样本，噁霉灵可湿性粉剂拌土的样本中变形菌门的丰度最低，酸杆菌门的丰度最高。说明微生物菌剂拌土会影响玉米农田土壤细菌门水平上的群落组成。

2.6.2 属水平上的群落构成。样本测序结果中不能分类的细菌属比例较大，图6显示玉米农田土壤中可以分类的相对丰度>1.0%的优势细菌属主要包括鞘氨醇单孢菌属（Sphingomonas）、节杆菌属（Arthrobacter）、类诺卡氏菌属（Nocardioides）、大理石雕菌属（Marmoricola）、Gaiella和芽孢杆菌属，其中节杆菌属、类诺卡氏菌属、大理石雕菌属和Gaiella都属于放线菌门，鞘氨醇单孢菌属于变形菌门，芽孢杆菌属于厚壁菌门。空白对照样本的Gaiella丰度高于其他处理，但节杆菌属、类诺卡氏菌属、大理石雕菌属和芽孢杆菌属的相对丰度低于其他样本。微生物菌剂M1和M2拌土处理的样本中节杆菌属、类诺卡氏菌属、大理石雕菌属、Gaiella和芽孢杆菌属

的丰度高于其他样本，M2样本的鞘氨醇单孢菌属丰度最高。噁霉灵可湿性粉剂样本的鞘氨醇单孢菌属丰度最低，节杆菌属、类诺卡氏菌属、大理石雕菌属、Gaiella和芽孢杆菌属的丰度低于M1和M2，但高于空白对照和MCK。说明微生物菌剂拌土会影响玉米农田土壤细菌属水平上的群落构成。

2.7 玉米农田土壤细菌群落的Tax4Fun功能预测

KEGG数据库（kyoto encyclopedia of genes and genomes）用于系统分析检测样本的基因组信息和功能信息。表3表明，微生物菌剂拌土后，玉米农田土壤中参与各种代谢通路、细胞转化、环境信息、有机系统以及引起人类疾病的微生物丰度发生了变化，但土壤中参与基因信息的微生物丰度没有变化。微生物菌剂M1和M2拌土降低了土壤中引起人类疾病、细胞转化的微生物丰度，提高了土壤中参与代谢通路的微生物丰度。Tax4Fun结果说明微生物菌剂拌土会影响玉米农田土壤微生物群落的基础生命功能，从而改善了土壤的生态功能。

3 结论与讨论

土壤微生物具有重要的生态功能，参与土壤中有机质的分解和腐殖质的合成，促进土壤养分的转化和循环，提高土壤肥力[17]。土壤微生物的生物活性容易受到土壤理化性质、种植模式、植物种类等因素的影响[18-19]。土壤微生物群落的多样性反映了土壤生态机制和逆境胁迫对微生物群落的影响，在一定程度上可用作土壤生态系统稳定性和土壤质量健康的评价指标[20]。目前，有关芽孢杆菌为功能菌的复合微生物菌剂拌土对黄河流域的玉米农田土壤微生物群落组成及其多样性的影响尚未见报道。笔者首次采用高通量测序技术对微生物菌剂拌土后玉米农田土壤细菌群落及其多样性进行了研究。微生物多样性测序技术具有高通量、操作简便、快速、数据精确、成本低等特点。笔者采用16S rRNA测序技术对微生物菌剂M1和M2拌土对宁夏玉米土壤细菌群落多样性和结构特征的影响进行了研究，得出了噁霉灵可湿性粉剂、微生物菌剂对照、微生物菌剂M1和M2对玉米品种济玉901土壤细菌群落丰富度、多样性和均匀度以及所属的门分类水平上的相对丰度。测序结果表明，检测样本的细菌群落在目、科和属水平上仍有较大比例的微生物不能明确分类，但在门水平上获得比较明确的分类名称信息。估计与测序序列长度、测序区间、比对的数据库以及16S rRNA基因本身的局限性等有关。

土壤pH与细菌群落多样性具有显著负相关性[18]，该研究证实微生物菌剂拌土处理组的土壤pH明显降低，但土壤细菌群落多样性明显增加。细菌喜欢生活在营养丰富、有机质易于分解的土壤环境中[20]。芽孢杆菌可以将土壤中植物难以吸收的营养元素转化为易吸收的营养物质，改善土壤的生态环境。该研究的2种复合微生物菌剂的功能菌是3种土壤来源的芽孢杆菌，拌土处理可以显著增加土壤中有机碳、有机质、硝态氮、有效磷、速效钾的含量，为土壤细菌的繁殖提供了丰富的营养环境，增加了细菌群落的物种丰富度和均匀度，提高了土壤生态系统的稳定性。因此，评价微生物菌剂对土壤微生物群落的影响具有重要的生态学意义。

土壤细菌群落在门水平上的组成主要包括变形菌门、放线菌门、拟杆菌门、酸杆菌门、厚壁菌门等，外源投入物对土壤细菌门的丰度影响显著。微生物菌剂M1和M2拌土后，玉米农田土壤細菌群落的变形菌门丰度下降，放线菌门的丰度增加，这与Chen等[11]、冯帅[12]、吕宁等[19]的研究结果较为一致。关于细菌属水平的组成影响，该研究结果与前人的研究差异较大。采用微生物菌剂M1和M2拌土后，玉米农田土壤细菌群落中的优势菌属主要是放线菌属和芽孢杆菌属，显著增加了土壤中有益微生物的丰度。土壤中病原菌的数量及其生物学活性的增加会破坏土壤微生物群落的稳定性与和谐性，从而危害地上部植物的正常生长[6-7] 。放线菌和芽孢杆菌可以产生多种抗菌活性物质和植物激素，可以抑制土壤中有害微生物的数量和危害，促进地上部植物生长，进而增强了土壤的生态服务功能[21]。

微生物群落多样性是否稳定会直接影响微生物的生态功能和整个生态系统。该研究中的微生物菌剂拌土后，参与各种代谢的微生物丰度明显增加，土壤中引起人类疾病的微生物丰度明显降低;恶霉灵可湿性粉剂处理后的玉米土壤微生物群落结构稳定性较差，土壤中引起人类疾病的微生物丰度增加。研究结果证实微生物菌剂拌土可以改变土壤微生物基本生命活性功能和代谢途径，从而改善土壤微生物对生态环境的调控效应，增强土壤的生态功能。

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