牛早期妊娠诊断的研究进展

郭腾龙，汝振远，任尚，杨贤树，张翔栋，申屠璐燕，张运海，曹祖兵

(安徽农业大学动物科技学院/地方畜禽遗传资源保护与生物育种安徽省重点实验室，安徽 合肥 230036)

随着我国经济的快速发展，人民生活水平不断提高，牛肉、牛奶等产品以其口感佳、营养高等优点受到大家的青睐，人民对牛肉、牛奶的需求日益增多。以前传统、落后、粗放的养殖模式已不能满足行业的需求而逐渐被淘汰并转变为规模化、标准化、精细化、产业化的养殖模式，通过不断优化饲养方式以及推广应用先进养殖技术，提高母牛的繁殖效率[1]。

母畜繁殖效率是影响养殖业经济效益的关键因素。相对于猪、羊等家畜，牛的产犊间隔长、产犊少，繁殖效率低，饲养成本高，所以提高母牛繁殖效率对于养牛行业尤为重要。制约母牛繁殖效率的因素有很多，诸如产犊间隔、配种技术、营养供给、养殖环境、管理水平、疾病防控等，其中受产犊间隔的影响最大，而配种后的早期诊断能有效缩短产犊间隔，提高母牛繁殖效率[2]。

早期妊娠诊断是在动物配种后3个月内，通过外部观察行为表现,或者测定体内生殖相关标志物的水平来判断母畜是否妊娠。配种后的母牛进行早期妊娠诊断，对已经确认妊娠的母牛进行精细化管理，满足母体自身和胎儿的营养需求，保证母牛能够正常的产犊和哺乳；而对未妊娠的母牛，应找出原因后及时进行第2次配种，并且淘汰多次配种后仍妊娠失败的母牛[3]。不及时或不准确的妊娠诊断都会导致母畜产犊间隔的延长，一头成年母牛每错过一个发情周期(平均21 d)，将增加70～114美元的非繁殖期饲养成本，而失配13.5个发情周期(大概283 d)，相当于损失一头牛犊以及这一泌乳期的泌乳量(荷斯坦牛一个泌乳期产奶3 000～5 000 kg)，这也进一步说明早期妊娠诊断是影响养殖效益的关键环节[4]。因此，养殖人员掌握准确的早期妊娠诊断方法是至关重要的，早期妊娠诊断旨在配种后能尽早区分妊娠母牛以便进行精细化管理，同时还能在诊断过程中发现母牛的一些生殖疾病，进行及时治疗能有效的减少妊娠母牛的流产风险，极大提高母牛的繁殖效率。

在妊娠初期，由于胎儿和胎盘的相互作用，母牛体内发生一系列新陈代谢的变化，导致妊娠母牛和空怀母牛的一些生理和生化指标存在一定的差异，例如生殖器官的功能、孕酮(progesterone，P4)、早孕因子(early pregnancy factor，EPF)、妊娠相关糖蛋白(pregnancy associated glycoproteins，PAGs)、干扰素tau(IFN-τ)、体温以及行为等方面[5-6]。人们基于这些指标的差异，开发出许多早期妊娠诊断方法，例如直肠触诊、超声波诊断、检测牛血中PAGs含量的早期妊娠诊断试剂盒、血小板计数法等。这些方法各有千秋，但总体都不太完善，存在诊断准确率低、操作繁琐、成本较高等现实问题，难以满足当今养牛行业的需求。因此，开发出一个准确、高效、低成本的早期妊娠诊断方法，对于养牛行业来说尤为重要。

早期妊娠诊断在养牛业应用最为广泛，技术也相对比较成熟，主要分为临床诊断和免疫学诊断，其中临床诊断是通过检查母体中胎儿、胎膜和羊水的存在状态来进行诊断，主要方法有直肠触诊、超声波检查法等；免疫学诊断则通过检测P4、PAGs和EPF在妊娠早期母牛的血液、尿液和乳汁中的浓度变化，来判断母牛是否妊娠，主要检测方法有放射免疫法(RIA)、胶体金免疫检测技术(GICT)和酶联免疫法(ELISA)等[7-8]。

1 临床诊断

1.1 直肠检查

黄体是卵泡细胞所形成的暂时性内分泌器官，主要功能是分泌P4，维持妊娠。妊娠初期形成的妊娠黄体，形状略大于周期黄体，柔软光滑，妊娠中期和后期则较硬[9]。子宫在植入受精卵后，其子宫角会随着胚胎的发育产生相应的变化，呈不对称的发展趋势，植入受精卵的一侧子宫角要比未植入的大，并且在妊娠中后期有较为明显的波动[10]。

牛的直肠触诊从首次提出到现在，已将近有两百多年的历史，目前仍是一些大型家畜妊娠诊断的主要方法。在人工授精50 d之后，通过触摸母牛卵巢黄体和子宫角形状、大小以及质感的变化，能对母牛是否妊娠作出较为准确的判断[11]。由于诊断过程中可能会引起母牛应激，经直肠触诊是否会造成母牛的流产这个问题一直存在争议，然而研究表明，经直肠触诊和和胎膜滑动技术并不会增加妊娠奶牛流产风险，前提是在专业的兽医以及严格规范的操作技术下进行[12-13]。虽然这种方法有着诊断成本低、准确率高等优点，但仅能用于人工授精后45～60 d的妊娠诊断，很难在配种后一个情期(约21 d)进行准确诊断，且操作复杂，会因为一些生殖疾病造成误诊，例如子宫积水或者子宫蓄脓等，如果操作不慎还会造成胚胎损失，增加母牛医源性流产的风险，所以需要技术员有丰富的操作经验[14]。

1.2 超声波诊断法

超声诊断法有超声多普勒检查法(D超)、幅度调整型超声诊断法(A超)、实时超声显像法(B超)，其中 D超准确率最高，但价格极其昂贵，A超操作复杂且准确率并不理想，所以前两者逐渐被市场淘汰，目前用的最广泛的还是B超[15]。B超在妊娠诊断有体外探查法、阴道检查法和直肠检查法，对于奶牛这种体型大、被毛较多的家畜，主要采用直肠检查法进行早期妊娠诊断[16]。通过探头检测回声信号，并把这种信号以光点明暗的形式从对应的显示器中显示出来，回声信号越强，光点越亮，反之则越暗[17]。羊水是一种均匀的介质，不会反射超声波，超声图像呈小圆形的液性暗区，压迫时变形，所以利用B超进行妊娠诊断主要是观察母牛羊水状态，必要时再检查卵泡和黄体，当超声波穿过母牛子宫时，显示器会显示各层面的的切面图像，根据显示器光点明暗差异来判断母牛是否妊娠[18]。贾国慧等[19]利用B超在奶牛妊娠26～28 d时进行妊娠诊断，准确率可达到90.48%。同时，利用B超还可以对母牛卵巢疾病进行辅助诊断，例如根据奶牛卵巢和子宫的回声状态来判断卵巢囊肿、持久黄体以及排卵延迟等，有效的提高生殖疾病的诊断率。尽管B超检查有着准确率高、操作方便等优点，但仍受到价格昂贵的约束，诊断成本偏高，中小型的养牛场很难配备牛用B超仪。

2 免疫学诊断

2.1 孕酮(P4)检测

整个妊娠期，奶牛血液和乳汁中都能检测到较高水平的P4，妊娠初期由黄体分泌，而妊娠中后期则是由胎盘的滋养层细胞分泌，因此P4含量可以用来作为判断母牛是否妊娠的重要依据[20]。刘瑞生[21]发现奶牛乳汁比血液中的P4含量高，并且取样更为方便，因此常测定乳汁中的P4含量来测定奶牛是否妊娠。常用放射免疫法(RIA)、酶联免疫法(ELISA)等方法测定奶牛乳汁孕酮(MP4)。

RIA是一种将放射性同位素的测量与免疫反应相结合的方法。在该方法中，放射标记抗原(抗体)与相应的抗体(抗原)结合，然后测定抗原-抗体结合物的放射性，并用于测定牛奶中孕酮的浓度。陈海燕等[22]用RIA法测定妊娠与非妊娠奶牛MP4含量，发现妊娠牛MP4含量从7～9 d开始极显著高于未妊娠牛(P<0.01),并随着时间增加, 差异持续增大。RIA测定奶牛MP4高效、准确和快速，但因其技术和设备要求较高，且有放射性伤害，因此一般不适合在牛场中使用。

ELISA结合了生物酶高效催化反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性，用于检测妊娠相关激素。当用标记有生物酶的抗体在牛奶中检测到抗原(P4)时，这种酶会与四甲基联苯胺(TMB)发生反应，导致牛奶变色，根据颜色的深浅推断P4浓度[23]。据此，现已开发出高效、快速的ELISA试剂盒。吴凌等[24]自制奶牛乳汁孕酮ELISA试剂盒，通过测定配种后19～23 d奶牛MP4浓度来进行妊娠诊断，阳性和阴性准确率分别达到93.3% 和95.8%。尽管ELISA试剂盒能在奶牛一个情期内作出较为准确的妊娠诊断，但其价格昂贵、试剂保存时间短，因而限制了该方法的广泛应用。

2.2 早期妊娠因子(EPF)检测

EPF又称早期妊娠因子，是一种妊娠依赖性多分子蛋白复合物，首次发现于大鼠血清中[25]。EPF在胚胎发育过程中作为滋养层自分泌和旁分泌的免疫耐受因子，在母体中发挥免疫调节作用，抑制母体对胎儿的免疫排斥并维持妊娠[26]。此外，奶牛在受精24 h后乳汁和血清中都能检测到EPF，一旦终止妊娠24～48 h之后，EPF将迅速消失，所以EPF在奶牛乳汁和血清中的变化可以用于早期妊娠诊断和监测早期胚胎的状态[27-28]。但是Cavanagh[29]认为，EPF不是胎盘特异性蛋白，肿瘤以及转化的细胞系均可引起EPF的释放，通过检测EPF来进行早期妊娠诊断可能出现假阳性结果，因此该方法仅适用于具备特定条件的实验室，并不适合作为养殖场常规检测手段。EPF常用玫瑰花环抑制试验和硫酸铜检测法等进行测定。

玫瑰花环抑制试验(rosette inhibition test，RIT)，其原理是在补体的作用下，EPF可以抑制T淋巴细胞与异种红细胞凝集形成玫瑰花样细胞团(玫瑰花环)，玫瑰花环的抑制滴度，即R值，可以间接检测血清EPF含量[30]。Ghaffari等[31]研究表明，当R值高于8时，可认定为怀孕，当R值低于4时则认定为未怀孕，如果R值在4～8之间，则需要重新检测。贺加双等[32]利用RIT法检测不同孕期(1～9月)肉牛血样，在配种后1个月左右，妊娠母牛和未妊娠母牛R值便出现差异显著(P<0.05)，且结果与Ghaffari一致。RIT能在母牛受精后24 h后，便可通过检测血清EPF进行妊娠诊断。但需要注意的是，该方法是根据检测免疫抑制活性，间接反应EPF的存在，检测结果受多种因素影响，而且该法操作繁琐、检测周期长，因此不适合作为一种常规的早期妊娠诊断方法。

硫酸铜法是利用硫酸根离子与EPF反应产生凝集的特性，对牛乳中的EPF进行定性分析，妊娠母牛乳汁中含有高浓度的EPF，能与硫酸铜反应产生云雾状沉淀，故而能作为一种早期妊娠诊断的方法。李青旺等[33]用硫酸铜法对57头黑白花母牛进行早期妊娠诊断，并通过直肠检查进行确诊，发现3%的硫酸铜对妊娠31～50 d的中午乳样检测精度最高，平均阳性率达到90.35%。该方法准确率高、操作简便，但其只适合于哺乳期奶牛，而且需要肉眼观察，诊断结果容易受到主观因素影响而降低可靠性。

2.3 妊娠相关蛋白(PAGs)检测

PAGs是胎盘滋养层双核细胞与母体子宫上皮细胞融合时，合成并分泌的一类特异性糖蛋白，在反刍动物妊娠过程中起着维持妊娠和免疫调节的作用，1982年Butler等首次从妊娠母牛的胎盘膜中分离出来PAGs[34]。妊娠期间，奶牛的乳汁和血清中均可检测到PAGs，并且PAGs浓度在受精后第25天开始逐渐升高，在第32天达到一个峰值，血清中的PAGs含量约为乳汁中的2倍[35]。然而，Commun等[36]利用ELISA法对妊娠奶牛进行妊娠诊断，结果显示乳汁和血清中PAGs浓度检测精度并无显著差异。另外有研究指出，在妊娠第31天，根据母牛体内PAGs的浓度变化，可以预测妊娠31～59 d内胚胎的死亡率，也就是说PAGs不仅可以作为早期妊娠诊断的标志物，还可以作为预测胚胎死亡的模型[37]。

PAGs检测法与EPF检测法存在相同的缺陷，即只能在特定实验室条件下进行，且PAGs检测法的技术要求和检测成本都要高于EPF检测法。然而随着研究的不断深入，近些年来出现了许多商业的PAGs检测试剂盒，在保持其高准确率的条件下不断优化检测技术，更加高效的PAGs检测技术指日可待。

2.4 IFN-τ检测

IFN-τ是一种新型I型干扰素，不仅具有I型干扰素的共同特征，如预防病毒感染、抑制细胞增殖等，还是一种反刍动物特有的妊娠识别信号，在牛妊娠14 ～25 d时由滋养层细胞分泌，主要作用是通过阻碍前列腺素2α(PGF2α) 释放来阻止黄体溶解，使P4持续分泌，并参与胚胎着床、胚胎建立等重要过程[38-39]。其作用类似于人绒毛膜促性腺激素(hCG)，因此可以用于反刍动物的早期妊娠诊断[40]。王晓艳[41]研究发现，IFN-τ通过与特定的miRNA互作来调节妊娠早期奶牛子宫内膜牛白细胞Ⅰ类抗原(BoLA-Ⅰ)的表达，进而减少母体对胎儿的免疫排斥，增加胚胎植入的成功率。朱喆[42]利用qPCR和Western blot技术对妊娠9～20 d的奶牛子宫内膜组织进行分析，发现相较于未妊娠奶牛，妊娠早期奶牛子宫内膜组织的IFN-τ转录水平显著升高。Green等[43]检测妊娠与未妊娠奶牛外周血白细胞干扰素tau刺激基因(ISGs)的表达，发现在妊娠18 d(约1岁)的初产母牛中，ISGs的表达显著增加，但是年龄较大的奶牛，在妊娠18 d时对ISG诊断的敏感性较低。Yoshino等[44]通过检测外周血白细胞ISGs的表达丰度，对受精3周的日本黑牛进行早期妊娠诊断，阳性诊断准确率和阴性诊断准确率分别为80%和94.6%。

Ahmad等[45]通过中性粒细胞裂解物ELISA检测表明，妊娠牛血清ISG浓度显著高于非妊娠牛，且在妊娠16 d时差异性最高，因此干扰素tau检测法有望能在母牛配种后16 d进行早期妊娠诊断。IFN-τ在反刍动物妊娠诊断上的研究才刚刚起步，相比于其他的免疫学诊断，干扰素tau 在牛早期妊娠诊断上的报道少之又少，将来随着研究的深入，干扰素tau检测法可能会像PAGs检测法一样，成为一种热门的牛早期妊娠诊断技术。

3 展望

妊娠期间，胎儿与母体发生一系列互作，导致妊娠母牛与未妊娠母牛体内生理生化指标产生显著差异，基于这些差异建立了多种早期妊娠诊断方法，但都不能满足当代养牛业的需求。直肠触诊需要丰富的临床经验，易造成误诊，且诊断时间晚，无法在配种后18～21 d内作出准确诊断；超声波诊断不仅需要熟练的操作技术，还受到仪器设备昂贵的限制；免疫学诊断大都存在操作复杂、耗时长或有放射性危害等缺陷，很难在养殖场内推广使用。开发出一个理想化的母牛早期妊娠诊断方法是畜牧研究者关注的热点话题，近年来，互联网+农业模式飞速发展，畜牧养殖业越来越智能化，机电传感和遥感技术也被应用于畜牧领域，根据母牛配种后的行为、温度、体重等生理变化进行早期妊娠诊断是未来的一个趋势，其优点在于不必接触母牛便可进行早期妊娠诊断，这种自动化的诊断方法既不会对胎儿造成损害又减少了母体的应激，同时还可以准确的监测返情，进一步提高母牛的繁殖效率[46]。另外，随着高通量测序技术的发展，越来越多的妊娠相关因子(如血清外泌体miRNA等)被发掘出来，这些生物标识物不仅能预测妊娠，还与一些疾病密切相关，因此通过检测妊娠相关标识物进行早期妊娠诊断会有很大的学术价值与应用前景[47]。