猪瘟病毒与宿主蛋白相互作用的研究进展

董望，井汇源，王海花，曹素芳，包文奇，吕慧芳*

(1. 河南牧业经济学院动物医药学院， 河南 郑州 450046；2. 郑州市兽医生物制品技术重点实验室， 河南 郑州 450046)

猪瘟是由猪瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)引起的一种猪的传染病，具有高度的接触传染性、流行广泛、发病频繁、死亡率高等特点，长期阻碍养猪业的健康发展。在中国，主要采用接种疫苗的方式来控制猪群中的CSFV感染，虽能有效控制猪瘟的大规模流行，但很多地方仍有猪瘟散发或地方流行[1]，仍是威胁我国养猪行业的一大疾病[2]。

CSFV是一种具有囊膜的球形单股正链RNA病毒，属于黄病毒科瘟病毒属。CSFV基因组长约12.3 kb，5′非编码区(含有IRES)、开放阅读框(ORF)和缺少poly A的3′非编码区共同组成了CSFV的基因组。ORF编码一个多聚蛋白前体，该前体在细胞蛋白酶和病毒特异的蛋白酶作用下逐步加工成成熟的4种结构蛋白(C、Erns、E1、E2)和8种非结构蛋白(Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B)[3]。CSFV感染过程中，宿主细胞蛋白与病毒蛋白的相互作用有利于病毒的吸附、穿入、复制、组装和释放过程。本文归纳了近年来CSFV蛋白与宿主蛋白相互作用的研究进展，并总结了宿主蛋白对病毒复制、宿主天然免疫应答及细胞凋亡方面的作用，以期能进一步理解CSFV的致病机制。

1 CSFV结构蛋白与宿主的相互作用

1.1 C蛋白

研究表明，CSFV通过C蛋白与血红蛋白β亚基(HB)的C端相互作用，抑制HB的表达，进而阻断HB介导的视黄酸诱导基因蛋白I(RIG-I)受体通路，导致RIG-I受体介导的β干扰素(IFN-β)的表达减少，从而有利于CSFV自身的复制[4]。另外，C蛋白泛素化位点的突变将阻断C蛋白与小类泛素化修饰蛋白1(SUMO-1)结合，致使C蛋白突变的病毒毒力减弱[5]。与C蛋白发生相互作用的还有细胞骨架的主要调控因子支架蛋白(IQGAP1)，破坏两者的结合将导致CSFV复制能力的减弱和毒力的降低[6]。此外，骨肉瘤扩增蛋白9(OS9)与C蛋白也存在相互作用，且CSFV C蛋白中与OS9互作位点的突变，导致CSFV复制能力的降低[7]。最新研究发现，小鼠的Mx1蛋白(一种干扰素刺激基因)R614E突变体与CSFV C相互作用，抑制CSFV复制，发挥其抗病毒活性，表明物种间Mx1的相对保守是其广谱抗病毒特性的基础[8]。因此，与CSFV C蛋白相互作用的宿主蛋白主要涉及抗病毒应答、蛋白泛素化及细胞骨架的调控等，主要参与天然免疫信号通路及泛素化蛋白的降解途径。C蛋白通过与宿主蛋白相互作用，维持CSFV的毒力，且帮助病毒逃避宿主的免疫应答，从而利于自身的复制。

1.2 糖蛋白Erns

Erns与双链RNA(dsRNA)结合，能拮抗Ⅰ型干扰素(IFN)信号的诱导[9]。另外，CSFV通过Erns与细胞膜表面的硫酸乙酰肝素(HS)相互作用吸附在细胞表面，去除细胞表面的HS将导致CSFV无法感染猪肾细胞。研究发现，层黏连蛋白受体(Lam R)是一种细胞表面的跨膜蛋白，与Erns存在相互作用，介导着CSFV的吸附与侵入[10]。因此，目前发现与Erns蛋白相互作用的宿主蛋白主要是细胞膜表面的蛋白，参与病毒的吸附与入侵。

1.3 糖蛋白E1

E1蛋白是猪瘟病毒的囊膜蛋白，通过半胱氨酸残基之间的二硫键与E2糖蛋白形成同源二聚体和异源二聚体，共同介导病毒的侵入过程。在CSFV感染性颗粒中，E1蛋白被包埋于C蛋白和E2蛋白内，因此其结构特点导致其无法刺激机体产生特异性抗体，但是E1蛋白的突变能影响病毒的毒力[11]。目前为止，尚未见到与E1蛋白相互作用的宿主蛋白的报道。

1.4 糖蛋白E2

E2蛋白一般以同源二聚体的形式存在于CSFV的囊膜上，是病毒入侵细胞的重要蛋白，同时E2蛋白也是CSFV的主要保护性抗原蛋白，以多种形式存在于受体细胞表面及病毒体内，诱导机体产生中和抗体，其糖基化位点决定CSFV的免疫原性[12]。E2在疫苗研制和抵抗病毒感染方面具有潜在的研究价值[13]。研究报道，在猪瘟病毒感染的早期阶段，细胞内的蛋白β-actin(细胞中的一种重要骨架蛋白)通过与E2相互作用，有益于病毒早期的复制[14]。细胞膜联蛋白(Anx2)是一种脂筏相关的支架蛋白，其与E2相互作用促进CSFV增殖，Anx2还可能参与病毒的吸附或者侵入[15]。硫氧还蛋白2(Trx2)是一种线粒体相关蛋白，参与多种细胞活动。Trx2通过与E2相互作用抑制CSFV的增殖，但是CSFV感染能抑制由Trx2介导的NF-κB信号通路的激活，进而利于病毒的复制[16]。丝裂原活化蛋白激酶激酶2(MEK2)与CSFV E2蛋白相互作用，促进CSFV复制[17]。蛋白磷酸酶1催化亚单位β(PPP1CB)是蛋白磷酸酶1(PP1)复合物的一部分，研究发现，在CSFV感染的细胞中E2能与PPP1CB蛋白相互作用，且PP1通路的激活能降低CSFV的复制[18]。研究发现，CSFV E2与猪蛋白激酶C1受体(RACK1)也存在相互作用[19]。此外，E2与SERTAD1相互作用，且在CSFV体内感染过程中，E2与SERTAD1的结合对病毒的毒力起关键作用[20]。CSFV E2与宿主蛋白CCDC115相互作用，该相互作用对CSFV在猪巨噬细胞中的复制及在家猪感染过程中的毒力发挥重要作用[21]。肌动蛋白亚基6(DCTN6)与CSFV E2的有效结合影响着病毒的毒力[22]。MERTK与CSFV E2蛋白相互作用，促进病毒的入侵，待病毒进入细胞后，MERTK又会下调IFN-β的mRNA表达，促进CSFV感染[23]。因此，与E2蛋白相互作用的宿主蛋白中，Anx2和MERTK为细胞膜上的蛋白，参与病毒的入侵。β-actin和DCTN6为细胞骨架蛋白，可能参与病毒蛋白的运输。Trx2和MEK2分别介导NF-κB和MEK2/ERK信号通路，参与病毒的复制。SERTAD1、CCDC115和DCTN6蛋白与CSFV的毒力有关。

2 CSFV非结构蛋白

2.1 Npro蛋白

Npro蛋白利用其蛋白水解酶活性将自身从新翻译的多聚蛋白中切割出来。Npro蛋白C端的锌结合域与干扰素调节因子3(IRF-3)发生相互作用，该相互作用能够诱导IRF-3蛋白的降解，从而减少了由IRF-3介导的Ⅰ型IFN(IFN Ⅰ)的表达[24]。Npro还可以与IRF-7相互作用，阻碍干扰素的诱导，从而帮助病毒逃逸先天免疫防御[25]。另外，Npro与IκBα(NF-κB的抑制剂)存在相互作用，提示Npro可能参与NF-κB信号通路的调节，下调天然免疫因子的转录[26]。CSFV Npro通过与宿主Poly(C)结合蛋白1(PCBP1)相互作用，抑制IFN Ⅰ信号通路，利于病毒的复制[27]。核糖体蛋白20(uS10)与CSFV Npro相互作用，且uS10通过正向调控Toll样受体(toll-like receptor，TLR)3的表达，发挥抗病毒的作用。但是，Npro蛋白和CSFV感染均能减少细胞中uS10的表达，从而削弱uS10的抗病毒作用，进而利于CSFV自身的复制[28]。TRIM56蛋白与CSFV Npro相互作用，并且下调TRIM56蛋白的表达能够促进CSFV的复制[29]。此外，抗凋亡蛋白HAX-1与Npro相互作用，使其从线粒体重新分布到内质网(ER)，增加了细胞对凋亡的抵抗力[30]。Npro蛋白还可以拮抗由双链RNA或线粒体抗病毒信号蛋白(MAVS)诱导的细胞凋亡[31]。研究表明，β-actin也与Npro蛋白存在相互作用[32]。因此，与Npro相互作用的宿主蛋白主要为天然免疫相关蛋白，参与宿主的天然免疫应答，Npro通过与这些蛋白相互作用，抑制宿主的天然免疫应答，从而有利于自身的复制。此外，Npro还可以与细胞凋亡相关蛋白相互作用，从而抑制病毒对细胞的凋亡作用。

2.2 p7蛋白

p7蛋白能促进IL-1β在巨噬细胞内的分泌[33]。p7属于II类病毒孔蛋白，可在细胞膜上诱导两种类型的孔隙[34]，这可能与病毒蛋白转运及病毒粒子释放有关。钙调节配体(CAMLG)是一种完整的ER跨膜蛋白，调节细胞内钙的释放和信号反应的产生。p7蛋白能与CAMLG相互作用，有效调节内质网中钙离子的通透性，破坏p7蛋白与CAMLG的结合，会影响CSFV的增殖[35]。

2.3 NS2蛋白

Kang等[36]通过酵母双杂交(Y2H)筛选与CSFV NS2相互作用的宿主蛋白，发现11种相互作用蛋白，主要参与细胞凋亡、应激反应、氧化还原或代谢等生物进程。

2.4 NS3蛋白

NS3与NS5B相互作用，增强NS5B RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)活性[37]。肿瘤坏死因子受体相关因子(TRAF)6属于天然免疫相关蛋白，具有抵抗病毒感染的功能。然而，CSFV NS3能与TRAF6结合，并降解TRAF6，从而减弱TRAF6介导的天然免疫应答，利于自身的复制[38]。TRAF5也能与NS3相互作用，通过激活p38 MAPK通路促进CSFV的复制[39]。蛋白酶体亚基10(PSMB10)与NS3相互作用，且PSMB10通过泛素-蛋白酶体系统降解NS3，CSFV抑制MHC I类抗原呈递相关转运蛋白的表达，而PSMB10可以恢复MHC I类抗原呈递的功能，抑制CSFV增殖[40]。因此，与NS3相互作用的蛋白主要涉及抗病毒免疫、蛋白泛素化及抗原的递呈等，参与NF-κB、p38 MAPK等信号通路，NS3通过影响这些蛋白，促进病毒的复制。

2.5 NS4A蛋白

NS4A通过与NS2-3或NS3相互结合，参与病毒颗粒的形成。另外，CSFV NS4A通过增强MAVS信号通路诱导IL-8的表达[41]。目前为止，尚未见到与NS4A相互作用的宿主蛋白的报道。

2.6 NS4B蛋白

NS4B蛋白C端具有假定的Toll/白细胞介素-1受体(TIR)样结构域，该结构域的突变将导致CSFV表型减弱，并减少强毒株Brescia株的复制[42]。研究表明，Rab5与NS4B相互作用并促进NS4B相关复合物的形成，利于CSFV增殖[43]。重链铁蛋白(FHC)与NS4B蛋白之间存在相互作用，且CSFV感染通过调控细胞内FHC表达水平而维持细胞内活性氧(ROS)水平的稳定，从而抑制细胞凋亡[44]。NS4B与TANK结合激酶1(TBK1)相互作用，可能参与CSFV的天然免疫调节[45]。猪环指蛋白114(pRNF114)是E3泛素连接酶，通过其C端结构域与CSFV NS4B蛋白相互作用，导致了K27连接的多泛素化，并通过蛋白酶体依赖途径降解NS4B，进而抑制CSFV的复制[46]。因此，与NS4B相互作用的蛋白主要涉及囊泡的运输、ROS的稳定、天然免疫和蛋白的泛素化降解等，主要参与病毒的组装、复制及细胞凋亡。

2.7 NS5A蛋白

NS5A蛋白可通过与病毒或宿主蛋白相互作用调控病毒基因组复制、蛋白翻译和组装。NS5A蛋白通过与病毒基因组的3′-NCR结合或通过与NS5B相互作用调节NS5B RdRp活性来调控病毒RNA复制[47]。宿主内的热休克蛋白70(HSP70)和FKBP8均能与NS5A蛋白发生相互作用并促进CSFV RNA复制[48]。真核翻译起始因子3亚基E(eIF3E)与NS5A相结合，且eIF3E通过增强CSFV内核糖体进入位点(IRES)的翻译活性而利于病毒的复制[49]。真核翻译延伸因子1亚基A(eEF1A)与NS5A相互作用，且能结合于CSFV IRES，降低IRES的翻译活性，从而抑制病毒的增殖[50]。另外，Anx2和Rab1A已被证明与NS5A相互作用以增强CSFV粒子的组装[51]。此外，细胞内的HSP27与NS5A相互作用，并通过NF-κB信号通路对病毒的增殖负性调控[52]。HSP90AB1/HSPCB与NS5A也存在相互作用[53]。鸟苷酸结合蛋白1(GBP1)与NS5A相互作用，其自身的GTPase活性将被NS5A蛋白所抑制，导致减弱了GBP1的抗病毒作用，有利于病毒的复制[54]。新的研究发现，Rab18，一个小Rab GTPase，与NS5A相互作用，是CSFV RNA复制和病毒粒子组装所必需的一种新的宿主因子[55]。NS5A与GRP78相互作用，在CSFV激活细胞未折叠蛋白质反应中发挥关键作用，且该相互作用对CSFV的复制起积极促进作用[56]。蝰蛇毒素(viperin)蛋白通过其自由基SAM结构域和N端结构域与NS5A相互作用，抑制CSFV复制[57]。与NS5A相互作用的蛋白较多，说明NS5A是一种多功能的蛋白。其中，HSP70、HSP27、HSP90AB1、HSPCB和GRP78为热休克蛋白，介导蛋白的折叠和转运，参与病毒的复制。eIF3E和eEF1A为真核翻译因子，介导蛋白的翻译过程，影响病毒的增殖。Anx2为脂筏支架蛋白，Rab1A和Rab18为GTP结合蛋白，介导膜转运和囊泡的运输，参与病毒的组装。GBP1和Viperin为干扰素刺激基因，影响病毒的复制。

2.8 NS5B蛋白

NS5B蛋白与NS3蛋白相互作用，分别增强了NS5B的RdRp活性和NS3的RNA解旋酶活性[58]。另外，在CSFV感染猪宿主细胞的过程中，细胞抗病毒蛋白Mx1结合于CSFV NS5B蛋白，抑制CSFV在宿主细胞中的复制[59]。

3 展望

病毒的生命周期主要包括吸附、侵入、脱壳、生物合成、组装和释放。细胞蛋白HS、Lam R与Erns蛋白相互作用，介导病毒的吸附。Anx2、MERTK与E2蛋白相互作用，介导病毒的侵入。eIF3E和eEF1A与NS5A蛋白相互作用，介导蛋白的翻译，影响病毒的增殖。HSP70、HSP27、HSP90AB1、HSPCB和GRP78与NS5A蛋白相互作用，介导蛋白的折叠和转运，参与病毒的复制。Rab5与NS4B蛋白相互作用以及Anx2、Rab1A和Rab18与NS5A蛋白相互作用，参与病毒的组装。细胞内β-actin与E2蛋白相互作用可以影响CSFV复制的早期阶段。另外，破坏SUMO-1、IQGAP1与C蛋白的相互作用，或SERTAD1、CCDC115、DCTN6与E2蛋白的相互作用，将导致病毒毒力减弱。此外，与Npro相互作用的HAX-1及与NS4B相互作用的FHC蛋白，参与细胞凋亡的调控。宿主细胞的天然免疫应答对抵抗病毒的感染至关重要，CSFV蛋白通过与多种天然免疫相关蛋白相互作用，从而有利于自身的复制，例如MX1、HB与C蛋白相互作用，Trx2与E2蛋白相互作用，IRF-3、IRF-7、IκBα、PCBP1、uS10、TRIM56与Npro蛋白相互作用，TRAF6、TRAF5与NS3蛋白相互作用，TBK1与NS4B蛋白相互作用，GBP1、Viperin与NS5A蛋白相互作用。综上所述，未来的研究应该集中于与p7、NS2、NS4A和NS5B相互作用蛋白的探索及病毒释放机制的研究。

猪瘟病毒蛋白与宿主蛋白相互作用的研究为了解CSFV的发病机制提供了重要的依据。尽管取得了这些进展，但是CSFV与宿主之间的许多分子作用机制仍不清楚。因此，还需要大量的研究来探索CSFV和宿主蛋白的相互作用。目前，常使用酵母双杂交(Y2H)技术筛选与病毒蛋白相互作用的宿主蛋白。此外，随着技术的快速发展，串联亲和纯化技术也被应用于筛选互作的宿主蛋白，加快了CSFV蛋白与宿主蛋白的研究。因此，结合新技术对CSFV蛋白与宿主蛋白互作的分子结构基础及CSFV的发病机制进行深入的研究是今后的研究方向之一，以期发现新的抗病毒因子或靶点，从而开发新的抗病毒药物或更高效的疫苗，促进猪瘟的控制和清除。综上所述，本文总结了目前为止CSFV与宿主的相互作用进展，进一步揭示了CSFV的致病机制，有助于猪瘟的防控。