浅析牛巨噬细胞内气肿疽梭菌细胞内存活机制

杨大伟，张光磊

吉林省敦化市农业农村局畜牧站，吉林 敦化 133700

气肿疽梭菌是黑腿病的病原体，气肿疽是国内反刍动物易感的一种严重性疾病，该病可引发肌肉坏死和毒血症，并伴随高死亡率。尽管众所周知预防该病暴发的重要性，但至今相关对黑腿病发病机制的研究却少之又少，并且很多研究基于未经证明的假设。其中一种假设认为转运气肿疽梭菌孢子从反刍动物的肠道到肌肉，是巨噬细胞起到主要作用的原因。因此，现在的研究目的在于检测气肿疽梭菌或者孢子在通过牛单细胞源的巨噬细胞的吞噬作用后是否能够保持活性，并展示出炎性反应以及由气肿疽活性细胞或者孢子感染牛巨噬细胞后产生相应的抗炎性细胞因子转录子。这些结果更能证实此典型的假设：在黑腿病的早期发病机制中，巨噬细胞可能起到十分重要的作用。

气肿疽梭菌是一种革兰氏阳性厌氧菌，可以形成气性坏疽，抑或在人和其它物种产生恶性水肿。气性坏疽通常发生在创伤污染物，一般是在接种疫苗、分娩、剪毛或者抽血期间，与此同时伴随着一种或多种梭状菌的感染从而导致该病，相比于恶性水肿，在没有任何创伤存在之前，气肿疽通常被认定为非创伤性或内源性疾病，但值得确认的是环境中的气肿疽梭菌的孢子在吞噬作用下随后通过巨噬细胞从肠道转移至肌肉，从而保持一种潜伏状态。一个小创口或者任何其他条件都会让这些组织中的氧气摄入量减少，进而导致气肿疽梭菌的激增，随后发展成为肌肉坏死甚至病畜死亡。尽管都知道预防气肿疽在牛的饲养中极其重要，但是直到现在仍然没有数据可以说明气肿疽梭菌和吞噬细胞之间的关系，事实上在先天免疫中关于巨噬细胞的抵御作用仅限于A型产气型荚膜梭菌，在巨噬细胞的内化后，气肿疽梭菌的细胞和孢子仍然保持活力，这种细菌可以引发动物的气性坏疽发生，进而再传染给人。因此该研究旨在检测气肿疽活细胞或者孢子通过牛单核细胞衍生的巨噬细胞的吞噬作用后的存活性，同时分析比较在此感染后的牛巨噬细胞的炎性以及抗炎性细胞因子转录子的属性。此外，该研究亦能证实梭菌属菌种感染牛单核细胞衍生的巨噬细胞的感染动力学和细胞因子属性。

1 材料与方法

1.1 准备菌株和牛巨噬细胞系

从病畜体内获取已经感染的细胞，进行气肿疽梭菌的菌株培养；并同时从健康的牛体内提取巨噬细胞进行细胞培养，每隔24 h换液。

1.2 感染巨噬细胞

将已经培养好的菌株感染牛正常的巨噬细胞系，然后继续培养24 h，每12 h换液。

1.3 形态学观察

将培养好的感染气肿疽菌株的牛巨噬细胞在电子显微镜下进行镜下观察，并记录其形态学特点。

1.4 单核细胞衍生的巨噬细胞分离、培养和感染

将单核衍生的巨噬细胞用离心机3 000转/s，4 ℃进行离心分离，弃上清液，再次清洗，转移至细胞培养液在二氧化碳细胞培养箱37 ℃培养，之后进行转染。

1.5 检测受感染牛单核细胞衍生的巨噬细胞后细胞因子属性

用检测细胞因子的专属ELISA试剂盒，检测感染后的巨噬细胞的炎性因子和抗炎性因子。

2 结果

2.1 测定感染牛巨噬细胞后的气肿疽梭菌的存活性

气肿疽梭菌的生长细胞和孢子通过牛巨噬细胞的吞噬作用后都保持存活状态。然而在繁殖体中的气肿疽梭菌在牛巨噬细胞中表现为逐渐地减少。在感染24 h后，细胞外存活梭菌被完全清除，然而尽管用大量的洗涤液，也不可能将所有的细胞外梭菌孢子清除干净，但是在受感染24 h以后，细胞外梭菌孢子数量显著减少相比较内化的梭菌孢子。超微结构分析感染动力学显示自始至终，细菌的形成（包括活性细胞以及孢子）是在吞噬小囊泡进行内化作用，细胞内孢子的完整性表明整个吞噬过程没有起到损伤菌体的作用。

2.2 气肿疽梭菌感染牛巨噬细胞后细胞因子转录子表现属性

在感染的12 h以后，被气肿疽梭菌活性细胞内化后的牛巨噬细胞诱导炎性细胞因子转录，与之相反的是，在感染的24 h以后，内化后的气肿疽梭菌孢子诱导大量的抗炎性细胞因子转录。

3 讨论

气肿疽梭菌感染在反刍动物里是一种常见的疾病。在牛中，黑腿病在临床上是一种众所周知的严重性疾病，但是它的发病机制至今还未被完全理解透彻，已经存在假设气肿疽梭菌孢子是通过巨噬细胞从肠道或口腔创伤转运到肌肉当中，一旦进入到这些组织中气肿疽梭菌孢子会保持休眠状态直到引发缺氧状态，在缺氧的条件下最终在初始期、激增期产生外毒素，这也是临床病变发生的原因。在现代的研究中，气肿疽梭菌的动力学在鼠科动物的巨噬细胞中研究的最多，在确认气肿疽梭菌能在传代细胞系存活后，开始对这种细菌在牛的单核细胞衍生的巨噬细胞中的动力学进行验证，并且在用气肿疽梭菌活性细胞或者孢子感染牛巨噬细胞后的细胞因子的炎性以及抗炎性转录子进行分析，同时将牛巨噬细胞中气肿疽梭菌的活化物与鼠科动物巨噬细胞中菌体活化物进行比较，对比二者抗炎性细胞因子转路子，可以间接判断其细胞因子转路子的属性，从而能够证明这个典型的假设在黑腿病早期的发病机制中，巨噬细胞可能起到很重要的作用。传统上致病的梭菌属是细胞外微生物的转录子转录而成，产生强有力的毒素致使感染的宿主造成一系列的严重损伤。然而在过去的几年里，研究表明在鼠科动物里，产气荚膜梭菌在巨噬细胞内化后仍然能够持续存活，我们的研究显示气肿疽梭菌在巨噬细胞吞噬作用后也能够保持抵抗细菌消除机制。之前的研究证明在鼠科动物中，在巨噬细胞的气肿疽梭菌的孢子在受到感染的72 h后仍能存活，这种结果可能是由于孢子在潜伏期的休眠性所导致的。