鱼类诺卡氏菌病的研究进展

陈海新，朱宇嘉，董碧莲，朱志东，蔡廷渠，宋健平，朱盛山

(1.广州中医药大学青蒿研究中心，广东 广州510405；2.广东药科大学中药开发研究所，广东 广州510006；3.广州市普精生物科技有限公司，广东 广州510663)

诺卡氏菌广泛分布于自然界的水源中，是一种条件致病菌。引起鱼类诺卡氏菌病的细菌主要有星形诺卡氏菌(Nocardia asteroides)、鱼诺卡氏菌(Nocardia seriolae)和杀鲑诺卡氏菌(Nocardia salmonicida)。鱼类诺卡氏菌病在每年的4－11月皆可发生，发病高峰主要集中在6－10月，在水温25～28℃时发病最为严重，死亡率最高。该病潜伏期长，从感染到发病一般需要15～20天，一旦鱼发病预后极差，采用抗生素疗效一般，死亡率高，疾病频发，给我国渔业造成严重的经济损失。如何防治鱼类诺卡氏菌病已经成为水产养殖业亟须解决的问题之一。

一、鱼类诺卡氏菌病的体征和病理表现

二、鱼类诺卡氏菌致病机制

1.鱼类诺卡氏菌入侵宿主及体内传播途径

满其蒙等(2012)通过腹腔注射、口灌、浸泡及创伤浸泡的方式使健康卵形鲳鲹感染鱼诺卡氏菌，感染后22天死亡率分别达到93.3%、66.7%、60.0%和73.3%，说明通过腹腔注射、口灌和浸泡都能使健康鱼致病，在自然感染的情况下鱼诺卡氏菌可从卵形鲳鲹消化道、损伤部位或鳃进入鱼体内。Wang F等(2017)把绿色荧光蛋白标记鱼诺卡氏菌并注射到透明虎刺鱼体内，用共聚焦显微镜实时观察诺卡氏菌在体内的致病过程，发现巨噬细胞内有大量的绿色荧光信号，绿色荧光蛋白标记的细菌被巨噬细胞吞噬并在细胞内增殖，从而导致巨噬细胞聚集、死亡和肉芽肿的形成，最后细菌通过血液播散到心、肝、肾和肌肉组织并永久定植，形成肉芽肿。

2.MCE(mammalian cell entry)蛋白介导的跨膜运动

3.鱼类诺卡氏菌病的免疫原性

索状因子是存在于流动外脂中分枝菌酸和海藻糖结合的一种糖脂，由一个酯化的海藻糖和两个分枝菌酸构成，是诺卡氏菌的毒性糖脂，成分为6,6-双分枝菌酸海藻糖。分枝菌酸可以诱导巨噬细胞转变为泡沫细胞，降低巨噬细胞的自噬能力和抗原提呈能力，使巨噬细胞成为病原体的“避难所”(李黎等，2015)。

抗原85复合物由Ag85A、Ag85B、Ag85C 3个蛋白组成(编码基因分别是fbpA、fbpB、fbpC)，负责将枝菌酸从一个海藻糖单枝菌酰酯转移到另一个海藻糖单枝菌酰酯，并将其转运到细胞壁阿拉伯半乳聚糖，形成海藻糖二枝菌酰酯(TDM)(罗红丽等，2012)。抗原85复合物在分枝杆菌感染中具有较强的免疫原性，可诱导抗体合成和T细胞介导的反应。在鱼的基因中至少由7个Fbp基因，分别是3个fbpA、2个fbpB和2个fbpC，Fbp编码的抗原85复合物也很可能是鱼诺卡氏菌引起免疫反应的原因之一(Yasuike M等，2017)。

4.鱼类诺卡氏菌的抗杀伤作用

5.抑制巨噬细胞的酸化

巨噬细胞吞噬病原微生物后胞内pH会迅速降到5左右。诺卡氏菌并不能在pH为5的培养基中生长，超过50小时就会丧失活力。鱼类致病诺卡氏菌在巨噬细胞体内仍然可以维持正常pH抵抗巨噬细胞的杀灭。这种预防吞噬体酸化的能力可能是细胞内病原体存活的先决条件。

6.引导巨噬细胞凋亡

三、鱼类诺卡氏菌病的复发机制

诺卡氏菌是革兰阳性细菌，细胞壁较厚，一般革兰阳性细菌细胞壁被破坏后就会死亡，部分诺卡氏菌细胞壁被破坏后仍然能够在巨噬细胞内存活，形成L型缺陷细胞壁，以缺陷形态继续存活，环境适合时可恢复典型诺卡氏菌形态。L型诺卡氏菌的存活是诺卡氏菌病复发的重要原因。

四、鱼类诺卡氏菌病检测技术

王国良等(2012)用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR的方法检测鱼诺卡氏菌，结果显示标准曲线的相关系数为0.998，检测灵敏度可达106毫克/毫升的DNA含量，与嗜水气单胞菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌、麦氏弧菌不发生交叉反应，在16份样品中全部检测出鱼诺卡氏菌，正确率为100%。王国良等(2011)对鱼诺卡氏菌16S～23S rRNA基因内转录间隔序列设计了4条LAMP引物，扩增产物经电泳后呈现特异性的LAMP梯形条带，建立了环介导恒温扩增技术(LAMP)检测方法，将该法应用于乌鳢、大黄鱼、黄姑鱼组织样品检测，准确检测出诺卡氏菌。夏洪丽等(2014)针对杀鲑诺卡氏菌的16S～23S转录间隔区序列扩增出128 bp的特异性片段，而对另外2种鱼类诺卡氏病致病菌、5种诺卡氏属近缘种及其他11种细菌均不扩增，对杀鲑诺卡氏菌DNA模板的检出浓度可低至28.3皮克/微升。

五、鱼类诺卡氏菌病的治疗

1.抗生素类

满其蒙等(2013)对恩诺沙星、红霉素及氟苯尼考体内治疗鲳鲹的鱼诺卡氏菌疗效进行研究，治疗1组和治疗2组分别在感染后1天和4天投喂药饵，连续投喂10天，恩诺沙星、红霉素及氟苯尼考治疗1组和治疗2组对卵形鲳鲹鱼诺卡氏菌感染的保护率分别53.34%和13.34%、43.34%和30%、60%和23.34%。满其蒙等(2013)对15株鱼诺卡氏菌进行药敏检测，结果显示，15株菌均对庆大霉素、恩诺沙星、链霉素及卡那霉素敏感，对氨苄西林耐药。蒋依依等(2012)用纸片扩散法测试鱼诺卡氏菌对抗生素的敏感性，28℃培养7天后测量抑菌圈直径，试验结果表明该株鱼诺卡菌对氯霉素、链霉素、卡那霉素、四环素等敏感，但对磺胺类和氨苄青霉素有耐药性。王二龙等(2015)用药敏纸片法测定鱼诺卡氏菌对22种抗生素的敏感性，结果显示鱼诺卡氏菌对四环素、强力霉素、美满霉素、阿奇霉素、磺胺异噁唑、利福平等敏感，对红霉素、呋喃唑酮、复达欣、妥布霉素中度敏感。

2.中草药

Ismail TF等(2017)从肉桂、百里香、麦冬和茶树中提炼出4种精油，对鱼诺卡氏菌ATCC43993、杀鲑诺卡氏菌ATCC27463和星形诺卡氏菌ATCC19247共80株诺卡氏菌进行药敏试验，肉桂精油、百里香精油、麦冬精油和茶树精油对星形诺卡氏菌最小抑菌浓度(MIC)分别可达5、10、20、160微克/毫升；百里香精油和肉桂精油联用时对鱼诺卡氏菌和杀鲑诺卡氏菌MIC分别为10微克/毫升和80微克/毫升。邓剑豪等(2018)使用二倍稀释法测定中药复方DS对诺卡氏菌的MIC值，结果为3.91毫克/毫升。

3.疫苗

六、讨论

鱼类诺卡氏菌病频发，起病隐匿，病程漫长；一旦发病预后极差，给养殖鱼产业造成严重的经济损失。诺卡氏菌进入宿主体内后可以逃离体内免疫细胞特别是巨噬细胞的杀灭，诺卡氏菌病周期漫长，初期诺卡氏菌数量较少，引起的炎症症状不明显，后期诺卡氏菌大量繁殖且难以被免疫细胞杀灭，会引起严重的炎症反应，同时机体不断修复损伤组织，最后形成肉芽肿，外观表现为结节，严重时形成脓肿或者瘘管。根据体征、内脏表现和镜下观察可做出初步推测，最终确诊需要生物技术的验证，其中环介导恒温扩增技术(LAMP)检测方法比传统PCR方法更为灵敏、快速和方便。

鱼类诺卡氏菌病前期症状不明显，有明显症状时多数已经进入后期阶段。肉芽肿包裹着大量的诺卡氏菌和坏死组织，虽然可阻止细菌扩散，但同时也阻止了抗生素等药物进入病灶，导致药物疗效一般。鱼类诺卡氏菌病前期无肉芽肿阻碍，早期使用药物可以大大提高药物疗效，改善病鱼预后。因此，在抗生素耐药的大趋势下，严密观察、提前预防、早期诊疗也可降低鱼类诺卡氏菌病的死亡率，为新型药物的研发争取时间。

鱼类诺卡氏菌病防治研究的主要方向有抗生素、疫苗和中草药等。目前国家禁止在渔业中使用多数对鱼类诺卡氏菌病有效的抗生素，反复使用几种抗生素不可避免地会出现耐药，且抗生素还会残留在鱼体内和水体中，不仅危害人类健康，而且污染环境。养殖户为了经济效益，不规范使用抗生素更是加剧了这种情况的发生。疫苗防治鱼类诺卡氏菌病有着广阔的前景，尽管有一些疫苗已经问世，但仍然处于实验室阶段，目前尚无针对鱼类诺卡氏菌病的商业疫苗，疗效还需时间检验。中草药已经有几千年临床使用经验，且来源广泛、价格低廉、疗效肯定、可防可治、不易耐药，对于治疗鱼类诺卡氏菌病有着巨大优势，但目前关于中草药防治鱼类诺卡氏菌病的研究较少，需要进一步研究。