骨髓间充质干细胞对急性重症胰腺炎大鼠的炎症抑制作用及对TLR4/NF-κBp65通路的关系

2021-04-14秦亚飞霍星光李秋霞徐玉生

中国普通外科杂志 2021年3期

秦亚飞，霍星光，李秋霞，徐玉生

（1.河南省周口骨科医院重症医学科，河南周口 466000；2.河南省周口市卫生计生监督局公共卫生监督二科，河南周口466000；3.郑州大学第一附属医院骨科，河南郑州 450000）

急性重症胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）是一种常见急危重症，并发症多，病死率高[1]。 SAP发病机制复杂，包括炎症反应、氧化应激损伤、细胞凋亡、微循环障碍等，发作时可激活胰蛋白酶，引发胰蛋白酶原分子活化，诱导分泌大量炎性细胞，引发胰腺组织炎症反应、细胞死亡等，还可增加肺损伤、肝损伤等并发症发生风险[2-3]。因此，探寻一种有效治疗方法，抑制SAP患者炎症反应，以减轻胰腺组织损伤，降低相关并发症发生风险，改善预后，具有重要意义。间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）是一种成体干细胞，具有多向分化潜能、低免疫原性，可参与机体免疫调节，目前已在类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等顽固性疾病治疗中取得一定进展[4-5]。近期研究[6]发现，MSC移植具有修复SAP胰腺组织损伤的潜能，但作用机制尚无深入研究。Toll样受体4（toll-like receptor 4，TLR4）/核因子-κBp65（nuclear factor-κBp65，NF-κBp65）通路是一种典型炎症信号通路，激活后能对炎性细胞因子表达进行调控，参与炎症反应过程[7]。相关报道[8]显示，SAP发病过程中TLR4/NF-κBp65通路激活发挥重要作用。本研究就骨髓MSC对SAP大鼠炎症抑制作用及其对TLR4/NF-κBp65通路影响进行分析，以探讨骨髓间MSC治疗SAP的可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物清洁级SD 健康雄性大鼠购自中国疾病预防控制中心，许可证号：SYXK（京）2019-0050，7～8 周龄，体质量280～320 g。所有大鼠均在室温22～24 ℃、相对湿度50%～60% 动物饲养房内适应性喂养7 d，标准饲料，无菌蒸馏水。本研究经实验动物伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 骨髓MSC 分离、培养、鉴定及制备造模前1 周，随机取5 只大鼠，2%戊巴比妥钠50 mg/kg （0.25 mL/100 g）腹腔注射麻醉，断头处死，自股骨、胫骨收集原始骨髓基质干细胞。骨髓腔以DMEM冲洗，培养瓶内放置细胞，加含20% 胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 U/mL 链霉素基础培养基，置于潮湿孵化器孵化，温度37 ℃，湿度95%。观察细胞融合超过80%时，经多酶消化、传代收获，取第5 代细胞进行鉴定，显微镜下观察细胞形态。经流式细胞仪检测干细胞表面标志物表达，所用抗体为CD45、CD90，以同型对照抗体作为对照。移植前，将50 mg/L 含4，6- 联脒-2- 苯基吲哚的无血清培养基加入骨髓MSC 培养瓶，避光，孵育，标记细胞，共24 h。未结合的4，6- 联脒-2- 苯基吲哚以磷酸缓冲盐溶液冲洗，0.25% 胰蛋白酶消化，吹打。1000r/min 离心，离心半径5 cm，共5 min，重复2 次。随后以1500r/min 离心，离心半径8 cm，共5 min，弃上清液。加入培养液，制备成细胞浓度1.0×106/mL 悬浮液。

1.2.2 骨髓MSC 活力检测采用细胞生长曲线、细胞贴壁率及细胞克隆形成率评估细胞活力。细胞生长曲线测定：取第5 代生长状态良好细胞，0.25%胰酶消化，接种在24 孔板，密度1×104/ 孔。每隔2 d，取3 个孔消化计数，各孔计3 次，取平均值，连续8 d，绘制生长曲线。细胞贴壁率测定：取第5 代生长状态良好细胞，0.25% 胰酶消化，经锥虫蓝染色计算活细胞百分比，在3.5 cm 培养皿内接种，浓度3.5×107/L，每隔2 h，随机选择 3 个培养皿计算细胞数，连测18 h，取平均值，绘制曲线。细胞克隆形成率测定：取第5 代对数生长期细胞，0.25%胰酶消化，在6 孔板内接种，密度100 个/孔，培养16 d。经锥虫蓝染色法计数克隆细胞数，计算细胞克隆形成率，即克隆细胞数/ 接种细胞数×100%。

1.2.3 模型制备与分组取40 只大鼠依据文献[9]制定SAP 大鼠模型：术前禁食12 h，2% 戊巴比妥钠50 mg/kg（0.25 mL/100g）腹腔注射麻醉，平卧位固定于手术台。取上腹部正中切口，胰腺头部显露，探查十二指肠乳头位置，于十二指肠乳头旁，经留置针刺破肠壁，探入胰胆管，插入深度 1.5 cm，肝总管以微血管镊夹闭。将3.5%牛磺脱氧胆酸钠0.1 mL/100 g 注入，注射速度0.1 mL/min，输注后保持压力10 min。以造模后肉眼下可见大鼠胰腺出现皂化斑形成、点状出血、坏死等变化，为造模成功标准。40 只大鼠造模成功36 只，成功率为90.0%。36 只大鼠随机分为模型组、MSC 腹腔注射组（腹腔注射组）、MSC 尾静脉注射组（尾静脉注射组）、MSC 腹腔注射、尾静脉注射（联合注射组），每组各9 只。另取9 只大鼠作为假手术组，假手术组仅开腹，翻动数次胰腺，关腹，不做其他处理。

1.2.4 动物干预造模成功后12 h 开始给药。腹腔注射组以1.0×106/mL 骨髓MSC 悬浮液进行腹腔注射移植，剂量10 mL/kg。尾静脉注射组以1.0×106/mL 骨髓MSC 悬浮液进行尾静脉注射移植，剂量10 mL/kg。联合注射组同时以1.0×106/mL 骨髓MSC 悬浮液进行腹腔注射、尾静脉注射，剂量10 mL/kg。假手术组、模型组以等量生理盐水腹腔注射，注射10 mL/kg。

1.2.5 取材及处理治疗后24 h，大鼠以2% 戊巴比妥钠50 mg/kg（0.25 mL/100g）腹腔注射麻醉，断头处死，打开腹腔，以静脉采血针穿刺下腔静脉，抽取3 mL 血液，以备检测血清AMS、LPS 水平；打开腹腔，找到并分离胰腺组织，将胰腺组织分为5 份。其中4 份置于液氮保存，以备检测炎症指标、氧化应激指标及TLR4、NF-κBp65 蛋白；另外 1 份置于4% 多聚甲醛固定，用于HE 染色。

1.2.6 胰腺组织病理形态学检测采用HE 染色法检测。取4% 多聚甲醛保存胰腺组织，甩干残余多聚甲醛溶液，梯度酒精脱水，二甲苯透明，包埋，切片，厚度3 μm。石蜡切片置于恒温箱，加热2 h。进行HE 染色，95% 乙醇浸泡2 min，100% 乙醇浸泡10 min。二甲苯透明，中性树胶封片。切片置于显微镜下观察，各切片随机选取5 个高倍视野（×200），分析胰腺组织病理形态学改变。根据Sehmidt 评分标准进行病理评分[10]。病理评分包括水肿、出血、坏死、炎症4 项。水肿：无水肿，计0 分；小叶间隔扩大扩张，计1 分；小叶间隔扩张，计2 分；腺泡隔膜弥漫扩张，计3 分；细胞间隙弥漫扩张，计4 分。出血：无出血，计0 分；1～2 处出血，计1 分；3～4 处出血，计2 分；5～6 处出血，计3 分；≥7 处出血，计4 分。坏死：无坏死，计0 分；1～4/HP 坏死，计1 分；5～10/HP坏死，计2 分；11～16/HP 坏死，计3 分；≥17/HP 坏死，计4 分。炎症：0～1/HP 炎症细胞浸润，计0 分；2～10/HP 炎症细胞浸润，计1 分；11～20/HP 炎症细胞浸润，计2 分；21～30/HP 炎症细胞浸润，计3 分；≥31/HP 炎症细胞浸润，计4 分。由2 名经验丰富的病理科成员独立进行评分，取平均值。

1.2.7 血清AMS、LPS 水平检测取大鼠下腔静脉血，4 ℃，4000r/min 离心，离心半径5 cm，共10 min，取上层血清。采用碘比色法检测血清AMS 水平，应用全自动生化分析仪进行检测。采用甲基试卤灵底物法检测血清LPS 水平，严格按照试剂盒使用说明书操作，根据产物红色的甲基试卤灵生成速率，对LPS 活性进行检测。

1.2.8 IL-6、IL-1β、TNF-α水平检测采用ELISA 法检测。取液氮保存胰腺组织，冰浴下制备10% 匀浆。4 ℃，10000r/min 离心，离心半径 8 cm，共10 min，取上清液。严格按照IL-6、IL-1β、TNF-α 试剂盒使用说明书操作。观察酶标仪450 nm处吸光值。以吸光值为纵坐标，以标准品浓度为横坐标，创建标准曲线，按照标本吸光值获得浓度。

第一、民间日常用银的习惯。在白银古道及其左近区域村落中，有日常使用银器的习惯。富裕人家一般置有银碗、银筷等生活器物，据传，银子遇到毒会变黑，假若饭菜有毒会被测出，确保生命安全。此外亦有佩戴银饰的习惯，如银手镯、银项圈、银脚镯、银链、银耳环、银耳坠、银发髻、银簪子，如果银饰越戴越白，被认为会戴银，属于富贵命，即“命好，会戴银”之说。相传自明中后期以来，闽东地区，出嫁女子多佩戴银发髻、银簪子等，据传：曾经有女子洞房之夜行房时，新郎精流不止，女子想起母亲曾经的交代，用银簪子刺向新郎腰间一穴位，终于化险为夷。此外，闽东还有众多畲族的银饰。

1.2.9 SOD、MDA 水平检测采用羟胺法检测SOD 水平。取液氮保存胰腺组织，冰浴下制备10%匀浆。4 ℃，3500r/min 离心，离心半径8 cm，共10 min，取上清液。严格按照SOD 试剂盒使用说明书操作，每组3 孔，实验重复3 次，取平均值。采用硫代巴比妥酸法检测MDA 水平。胰腺组织加入10 mL 离心管，相同体积磷酸缓冲盐溶液加入调零管。各管分别加入0.6% TBA 溶液2 mL，混匀，沸水浴15 min。完成沸水浴后快速流水冷却，取离心管液体，4 ℃，10000r/min 离心，离心半径5 cm，共10 min，取上清液，加入酶标板。观察各组酶标仪450 nm、532 nm、600 nm 波长处吸光度值，以6.45（D532nm-D600nm）-0.56D450nm计算MDA 水平。

1.2.10 胰腺组织TLR4、MyD88、NF-κBp65 mRNA 相对表达量检测采用RT-PCR 法检测。取液氮保存胰腺组织，经Trizol 法提取总RNA。经紫外分光光度计检测提取的总RNA 质量、浓度，将总RNA 进一步逆转录成cDNA，实施RTPCR 反应。采用GeneBank 基因库内大鼠TLR4、MyD88、NF-κBp65 基因序列。引物设计：TLR4正向：5'-GAG GACTGG GTG AGA AAG GA-3'；反向：5'-GAA ACT AGG GAT GGT GAG GA-3'。MyD88 正向：5'-ATC GCT GTT CTT GAA CCCTCG-3'；反向：5'-CTC ACG GTCTAA CAG GCC AG-3'。NF-κBp65 正向：5'-ATG TTC CAD GTA TGA CTA TCA GG-3'；反向：5'-GAA GAG ACC AGT AAT CAC GAC A-3'。β-actin 正向：5'-TAC GAT TCT CCC ATC AACT-3'；反向：5'-GTCTGG TAA TCT CGC ACT C-3'。反应条件：95 ℃变性，3 min；95 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，30 s；72 ℃，10 min，40 个循环。反应体系：12.5 μL Power Taq PCR Master Mix，1 μL 上游引物、下游引物，1.5 μL cDNA。琼脂糖凝胶电泳，采用凝胶图像分析系统分析电泳条带，以β-actin 为内参，计算TLR4、MyD88、NF-κBp65 mRNA 相对表达强度（2-△△CT）。

1.2.11 胰腺组织TLR4、MyD88、NF-κBp65 蛋白相对表达量检测采用Western blot 法检测。取液氮保存胰腺组织，置于玻璃匀浆容器，加入 1 mL PIPA 裂解液、蛋白酶抑制剂，冰上匀浆，超声粉碎机粉碎。4 ℃，12000r/min 离心，离心半径5 cm，共15 min，取上清液。以等体积2× 上样缓冲液加入，煮沸，共10 min，蛋白变性，收获组织总蛋白。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜反应。加入5% 脱脂奶粉，室温下，摇床封闭2 h。加入TLR4、MyD88、p-NF-κBp65、NF-κBp65 一抗（1:500），4 ℃，孵育过夜；加入山羊抗兔二抗IgG（1:5000），室温下孵育2 h。孵育后，室温下以TBST 摇床洗膜10 min，共3 次。曝光，显影，定影，置于凝胶成像仪，观察TLR4、MyD88、p-NF-κBp65、NF-κBp65 蛋白表达。以ImageJ 图像分析软件，对各目标条带的灰度值进行分析。以β-actin 为内参，目的蛋白表达水平根据目的蛋白条带灰度值/β-actin 条带灰度值计算。

1.3 统计学处理

采用SPSS 19.0统计软件分析数据，计量资料以均数±标准差（±s）表示，重复计量资料比较采用单因素方差分析，两两样本比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 骨髓MSC 鉴定

显微镜下显示骨髓MSC呈梭形、漩涡样生长（图1）；流式细胞仪显示细胞低表达CD45，表达量为1.25%；高表达CD90，表达率为99.89% （图2）。

2.2 骨髓MSC 活力检测

细胞生长曲线结果显示，第5 代细胞生长曲线呈“S”形，1 d内为潜伏期，2～5 d为对数生长期，自第6 d细胞生长减慢，第8 d进入停止期。细胞贴壁率结果显示，第5代活细胞比例为97%，接种14 h贴壁率达高值，此后呈稳定状态，贴壁率（96.12±0.85）%。细胞克隆形成率结果显示，第5代细胞接种6 d镜下出现细胞集落。这些结果提示第5代细胞活力良好（图3）。

图1 第5 代骨髓MSC 形态（×100）Figure 1 Morphology of bone marrow MSCs at 5th passage (×100)

图2 流式细胞分析 A：低表达CD45（1.25%）；B：高表达CD90（99.89%）Figure 2 Flow cytometry analysis A: Low CD45 expression (1.25%); B: High CD90 expression (99.89%)

图3 骨髓MSC 活力检测 A：第5 代骨髓MSC 生长曲线；B：第5 代骨髓MSC 的贴壁率Figure 3 Determination of the viability of the bone marrow MSCs A: Growth curve bone marrow MSCs at the 5th passage; B: Adherence rate of the bone marrow MSCs at the 5th passage

2.3 胰腺组织病理形态学及病理评分

假手术组胰腺组织形态正常，结构清晰，间质鲜见炎性细胞浸润。模型组胰腺组织腺体结构紊乱，存在大量坏死细胞，腺泡出现水肿、破裂，伴有大量炎性细胞浸润，腺体间隙及血管周围存在红细胞渗出。与模型组比较，腹腔注射组、尾静脉注射组、联合注射组胰腺组织病理变化不同程度减轻，腺体结构轻微紊乱，腺泡轻微水肿，炎症细胞浸润减少，其中联合注射组改善更为明显（图4）。各造模组水肿、出血、坏死、炎症评分比较，差异有统计学意义（均P ＜0.05）。模型组、腹腔注射组、尾静脉注射组、联合注射组的水肿、出血、坏死、炎症评分依次降低，组间差异均有统计学意义（均P＜0.05）（表1）。

2.4 血清AMS、LPS 水平

与假手术组比较，各造模组AMS、LPS水平比均明显升高（均P ＜0.05），但两项指标在模型组、腹腔注射组、尾静脉注射组、联合注射组的升高程度依次降低，组间差异均有统计学意义（均P＜0.05）（表2）。

2.5 IL-6、IL-1β、TNF-α 水平

与假手术组比较，各造模组IL-6、IL-1β、TNF-α水平均明显升高（均P＜0.05），但各项指标在模型组、腹腔注射组、尾静脉注射组、联合注射组的升高程度依次降低，组间差异均有统计学意义（均P＜0.05）（表3）。

2.6 SOD、MDA 水平

与假手术组比较，各造模组SOD水平明显降低、MDA水平明显升高（均P＜0.05），且两项指标的变化程度在模型组、腹腔注射组、尾静脉注射组、联合注射组依次降低，组间差异均有统计学意义（均P＜0.05）（表4）。

图4 各组大鼠胰腺组织病理形态学改变（HE×200） A ：假手术组；B ：模型组；C ：腹腔注射组；D ：尾静脉注射组；E ：联合注射组Figure 4 Comparison of pathological changes of the pancreatiCTissue in each group (HE×200) A: Sham operation group; B: Model group; C: Intraperitoneal injection group; D: Tail vein injection group; E: Combined injection group

表1 各组大鼠胰腺病理评分比较（±s，n=9）Table 1 Comparison of pathological scores of pancreas among groups (±s, n=9)

注：1）与假手术组比较，P＜0.05；2）与模型组比较，P＜0.05；3）与腹腔注射组比较，P＜0.05；4）与尾静脉注射组比较，P＜0.05Note: 1) P＜0.05 vs.sham operation group; 2) P＜0.05 vs.model group; 3) P＜0.05 vs.intraperitoneal injection group; 4) P＜0.05 vs.tail vein injection group

组别水肿出血坏死炎症假手术组 0.20±0.12 0.20±0.11 0.20±0.11 0.20±0.13模型组 3.60±0.151) 3.20±0.131) 1.80±0.121) 2.40±0.151)腹腔注射组 1.80±0.151),2) 2.20±0.141),2) 1.60±0.131),2) 1.80±0.131),2)尾静脉注射组 1.60±0.151),2),3) 1.80±0.121),2),3) 1.20±0.121),2),3) 1.20±0.131),2),3)联合注射组 1.20±0.181),2),3),4) 1.20±0.121),2),3),4) 0.80±0.111),2),3),4) 0.80±0.141),2),3),4)F 586.723 748.207 418.726 528.307 P ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.7 TLR4、MyD88、NF-κBp65 mRNA 相对表达量

与假手术组比较，各造模组TLR4、MyD88 mRNA相对表达量均明显升高（均P＜0.05），且两项指标的变化程度在模型组、腹腔注射组、尾静脉注射组、联合注射组依次降低，组间差异均有统计学意义（均P＜0.05）；各组NF-κBp65表达水平组间差异无统计学意义（P＞0.05）（表5）。

2.8 TLR4、MyD88、p-NF-κBp65、NFκBp65 蛋白相对表达量

与假手术组比较，各造模组TLR4、MyD88蛋白相对表达量及p-NF-κBp 65/NF-κBp65 均明显升高（均P ＜0.05）。且各项指标的变化程度在模型组、腹腔注射组、尾静脉注射组、联合注射组依次降低，组间差异均有统计学意义（均P＜0.05）（图5）（表6）。

图5 Western blot 检测胰腺组织TLR4、p-NF-κBp65、NF-κBp65 蛋白表达Figure 5 Protein expressions of TLR4, p-NF-κBp65 and NFκBp65 in pancreatiCTissue determined by Western blot

表6 各组TLR4、MyD88、p-NF-κBp65、NF-κBp65 蛋白相对表达量比较（±s）Table 6 Comparison of relative protein expressions of TLR4, MyD88 , p-NF-κBp65 and NF-κBp65 among groups (±s)

组别 TLR4 MyD88 p-NF-κBp65/NF-κBp65假手术组 0.21±0.05 0.17±0.02 0.76±0.06模型组 0.65±0.081) 0.42±0.041) 1.35±0.081)腹腔注射组 0.41±0.051),2) 0.35±0.021),2) 1.15±0.091),2)尾静脉注射组 0.38±0.041),2),3) 0.28±0.041),2),3) 0.96±0.071),2),3)联合注射组 0.31±0.041),2),3),4) 0.25±0.041),2),3),4) 0.88±0.081),2),3),4)F 85.430 73.366 82.883 P ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

3 讨论

SAP起病急，病情重，可引发胰腺出血、坏死，且易继发全身炎症反应综合征、多器官功能障碍，病死率高[11-12]。当前，围绕SAP机制及治疗的众多研究[13-15]表明，中性粒细胞分泌的细胞因子在该病病理、生理变化中有一定作用，如TNF-α。TNF-α属于炎症始动因子，可介导IL-6、IL-1β、IL-8等多种炎症细胞因子释放，且能激活氧自由基、一氧化氮生成，促进白细胞趋化、黏附，造成胰腺组织受损[16]。故需在SAP治疗中，探寻有效手段抑制炎症反应，减轻胰腺组织损伤，改善预后。骨髓MSC是一种成体干细胞，分化潜能较高，可经分泌TNF-α、IL-6等细胞因子，参与机体炎症及免疫调节[17-18]。相关报道[19]显示，骨髓MSC可随机体血液循环到达受损部位，经诱导分化成相应成体细胞，促进组织损伤修复，控制炎症反应。还有报道[20]显示，随着机体骨髓MSC的细胞量增多，干细胞转化率逐渐升高，可促使炎性症状减轻，炎性介质减少，但就骨髓MSC对SAP炎症抑制调控机制尚无明确报道。而本研究就该问题进行分析，着重探讨骨髓MSC对SAP炎症抑制作用及机制，对SAP临床诊断、治疗有一定指导意义。

SAP治疗最直接的干细胞应为胰腺干细胞，但其数量少，再生能力低，较难满足胰腺损伤修复需求。而骨髓MSC取材方便，数量多，易培养，可分化成胰腺、血管、神经细胞等组织细胞，达到治疗目的，还能经由对SAP时过度炎症反应进行调节，控制炎症因子释放，减轻胰腺损伤[21]。报道[17]发现，骨髓MSC可在体内进一步转化成胰腺干细胞，进行再生、自我修复，减轻胰腺组织损伤。还有相关动物实验[22]表明，经腹腔与尾静脉联合注射骨髓MSC，在控制SAP大鼠炎症细胞因子上效果显著，但并未就其作用机制进行深入分析。本研究发现，骨髓MSC治疗后IL-6、IL-1β、TNF-α、MDA及血清AMS、LPS水平降低，SOA升高，联合注射组改善更显著，说明骨髓MSC腹腔联合尾静脉注射移植可减轻SAP大鼠炎症反应、氧化应激反应，缓解病情。进一步分析胰腺组织病理形态学变化，还发现骨髓MSC腹腔联合尾静脉注射移植可减轻SAP大鼠胰腺组织损伤。傅明杰等[23]也发现，骨髓MSC经腹腔与尾静脉联合注射可促使SAP大鼠胰腺病理评分降低，减少中性粒细胞浸润、出血、水肿等，减轻炎症反应，但具体作用机制仍未明确。

TLR4/p-NF-κBp65通路在SAP炎症反应调控中发挥重要作用，基因通常包括TLR4、MyD88、NF-κB3种[24-25]。NF-κB是一种蛋白质因子，能对细胞内多种基因转录过程进行调控，且可结合细胞因子、黏附因子等基因启动子，促进基因表达，而NF-κBp65为NF-κB激活后主要存在方式[26-27]。胰腺细胞表面TLR4分布较多，一旦胰腺受缺血、感染、损伤等因素刺激，可激活TLR4，并经胞内一系列信号传导引发MyD88、NF-κB活化，对NF-κB上游IκB进行激活，使得p65进入细胞核，调控较多炎性细胞因子表达[28]。相关报道[29]显示，抑制TLR4/p-NF-κBp65通路，能对SAP小鼠胰腺组织产生保护作用，减轻胰腺损伤。本研究发现，骨髓MSC能促使TLR4、MyD88 mRNA相对表达量及TLR4、MyD88白表达量降低，p-NF-κBp65/ NF-κBp65比值下降，且腹腔联合尾静脉注射移植给药时改善效果更显著，这说明骨髓MSC腹腔联合尾静脉注射可有效抑制TLR4/NF-κBp65通路，这可能是其抑制SAP大鼠炎症反应，减轻氧化应激反应，修复胰腺组织损伤的一个重要作用机制。

综上所述，骨髓MSC腹腔联合尾静脉注射能抑制SAP大鼠炎症反应，减轻氧化应激反应，缓解胰腺组织损伤，作用机制可能与抑制TLR4/NF-κBp65通路有关。但本研究也存在不足之处，比如涉及的样本量较少，且骨髓MSC抑制SAP大鼠炎症反应是否存在其他方面机制尚不明确，今后仍需深入分析。