饲粮添加新产玉米对肉仔鸡生长性能及肠道微生物区系的影响

■杜宝龙 王 璇 唐德富* 年 芳，2 邢露梅

（1.甘肃农业大学动物科学技术学院，甘肃兰州730070；2.甘肃农业大学理学院，甘肃兰州730070)

我国是世界上主要的玉米种植国之一，据联合国粮农组织（FAO）的统计，2018 年中国玉米产量达2.71 亿吨，位居世界第二[1]。虽然我国玉米产量相对丰富，但是有相当一部分玉米原料被用于生产生物燃料和工业制品，导致畜牧养殖用玉米需求相对紧张[2-3]。每年10 月份大量新产玉米上市，许多饲料企业和养殖企业为了降低生产成本往往会增加新产玉米在饲料配方中的添加比例或完全利用新产玉米替代旧玉米，而在生产中已发现使用新产玉米后，肉仔鸡会产生一系列营养、病理问题，如腹泻、饲料转换率下降、死淘率升高、粪便中可见完整的玉米颗粒等，生产上把这种现象称为“过料综合征”或“肠毒综合征”[4]。早期研究也发现，新产玉米熟化不完全，缺乏后熟期，因此其自身抗性淀粉含量较高。抗性淀粉黏度大，在小肠中不易消化，在大肠中易被微生物利用产生毒素，动物摄食过多时，会引起消化不良甚至腹泻[5]。此外肉仔鸡肠道中分布大量微生物，与宿主共同构成了一个相对稳定的内环境，互利共生，参与营养物质的吸收、分布、代谢以及机体免疫，并影响动物生长和健康[6-7]。有研究表明饲粮中不同类型碳水化合物会影响宿主肠道微生物的数量和相对菌群的变化[8-10]。然而国内外关于饲喂新产玉米饲粮对肉仔鸡肠道微生物区系影响的研究未见报道，因此本试验通过评估日粮添加不同比例新产玉米对肉仔鸡生产性能和肠道微生物区系的影响，以期从肠道微生物区系的角度解析新产玉米对肉仔鸡肠道存在的潜在影响，为新产玉米在肉仔鸡养殖中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用玉米为甘肃当地黄色品系玉米，收获之后晾晒12 d，使得水分低于14%，即得到新产玉米样品（水分含量为12.89%，风干基础）。旧玉米（水分含量为12.03%，风干基础）与新玉米品系和产地均相同，置于储藏室保存约14个月，储藏室保持通风干燥，并且每隔半年用磷化氢杀虫一次。试验用科宝肉鸡购自宝鸡大成禽业有限公司。

1.2 试验设计与饲粮组成

采用单因素完全随机设计，选取288 只1 日龄健康科宝肉鸡仔公雏，随机分为4组，每个处理组设6个重复，每个重复12 只鸡，分别饲喂对照组（占饲粮总量60%的旧玉米）、处理Ⅰ组（占饲粮总量40%旧玉米+占饲粮总量20%新玉米）、处理Ⅱ组（占饲粮总量20%旧玉米+占饲粮总量40%新玉米）、处理Ⅲ组（占饲粮总量60%新玉米）4种日粮。试验期为42 d，分前期（1～21 d）和后期（22～42 d）两阶段进行。

基础饲粮配方参考中华人民共和国农业行业标准《鸡的饲养标准》(NY/T 33—2004)中肉鸡营养成分推荐值配制，计算配方时，饲料原料中粗蛋白、钙、磷的含量使用实测值，其他营养指标参考中国饲料数据库2017年中国饲料成分及营养价值表。试验饲粮配方组成及营养水平见表1。

表1 试验饲粮配方组成及营养水平（风干基础）

1.3 试验动物饲养管理

试验鸡舍为封闭式三层笼养舍，各笼上下温度变化为±2 ℃，各处理各重复之间充分考虑位置效应安排。温度控制采用水暖控温，在饲喂前期温度由35 ℃逐渐递减为24 ℃，后期温度恒定控制在24 ℃。饲养期间自由饮水，自由采食，每天23 h 连续光照。免疫程序严格按照科宝肉仔鸡免疫管理手册执行。

1.4 生长性能测定

试验期准确记录各重复组鸡只采食量以及抛撒料重量，观察鸡只死亡情况，记录死淘数量。分别于0、21、42 日龄以重复为单位称量体重，肉仔鸡称重前禁食12 h，自由饮水，以重复为单位称量体重。计算各处理组平均日采食量（ADFI）、平均日增重（ADG）以及料重比（F/G）。

1.5 肠道食糜样品采集与微生物测序

试验鸡42 日龄时，分别从对照组和处理Ⅲ组各挑选体重与平均体重接近的6 只公鸡（每个重复1 只鸡）屠宰，剥离其回肠和盲肠，采取肠道内容物2 mL于冻存管中，液氮速冻，-80 ℃保存。高通量测序选择细菌16S V3～V4区，测序工作由北京诺和致源科技有限公司完成。

1.5.1 微生物DNA提取和PCR扩增

样本基因组DNA 采用十二烷基磺酸钠（SDS）法提取，利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA 浓度和纯度。取适量DNA 样品于离心管中，使用无菌水稀释至1 ng/μL。然后以稀释后的DNA 为模板，带有barcode的特异引物341-F(5’-CCTAYGGGRBGCASCAGG-3’)和806-R(5’-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3’)对样本基因组DNA进行扩增，获得PCR产物。

1.5.2 PCR产物混样纯化与文库构建

利用2%浓度的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测。根据PCR 产物浓度等量混匀，继续使用2%浓度的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，对目的条带进行割胶回收。使用建库试剂盒（TruSeq® DNA PCRFree Sample Preparation Kit）进行文库构建，构建文库经Qubit 和Q-PCR 定量，合格后使用HiSeq2500 PE250上机测序。

1.6 数据统计分析

所有数据经Excel 2010初步处理，肉仔鸡生产性能数据统计分析使用SPSS 21.0 单因素方差分析模块，差异显著时使用Duncan's法进行多重比较。微生物测序原始数据使用FLASH（V1.2.7）对样品的reads进行拼接，得到原始Tag 序列，然后参照Qiime（V1.7.0）的Tags质量控制流程和Gold database数据库进行比对，获得有效Tag 序列。利用Uparse 软件（Uparse v7.0.1001）对有效Tag 序列聚类，默认以97%的相似性将序列聚类为OTUs（Operational Taxonomic Units），用Mothur方法与SILVA的SSUrRNA数据库进行物种注释分析，获得科水平和属水平的分类信息。利用Qiime 软件（Version 1.7.0）计算α多样性指数，β多样性Unifrac距离，并使用R软件（Version 2.15.3）绘制稀释曲线，PCoA 图。肠道微生物两组之间α多样性、菌群丰度分析采用SPSS 21.0 软件T 检验模块完成。显著性水平设定为P＜0.05。

2 结果分析

2.1 饲粮添加新产玉米对肉仔鸡生长性能的影响(见表2)

表2 饲粮添加新产玉米对肉仔鸡生长性能的影响

由表2可以看出，随着饲粮中新产玉米添加比例增加，肉仔鸡平均日增重呈下降趋势，而料重比呈增加趋势，且处理Ⅲ组前期、后期肉仔鸡平均日增重均显著低于对照组及处理Ⅰ组（P＜0.05），而料重比前期、后期显著高于对照组及处理Ⅰ组（P＜0.05）。各处理组间采食量均无显著差异（P＞0.05）。

2.2 肉仔鸡回肠、盲肠微生物16S rRNA 测序质量分析和α多样性估计

从24 个肉仔鸡回肠、盲肠微生物样本中总共获得了有效Tag 序列1432 008 条。对样本测序结果按照序列距离聚类之后，平均每个样本得到758 个OTUs。回肠和盲肠稀释曲线结果显示，随着每个处理组测序数量的增加，OUT 数目已渐趋于饱和（曲线趋于平缓），说明测序深度足以覆盖到样本中的所有物种（见图1）。另外，回肠、盲肠所有样品的覆盖率都达到了0.99，表明测序结果准确性和重复性良好（表3、表4）。回肠α多样性指数显示，对照组和处理组间Shannon指数、Simpson 指数和Chao1指数均无显著差异（P＞0.05）（表3）。盲肠α多样性指数结果显示处理组Simpson 指数显著高于对照组，表明处理组物种多样性较对照组丰富（P＜0.05）（见表4）。

图1 回肠、盲肠微生物16S rRNA基因测序稀释曲线

表3 新产玉米对肉仔鸡回肠α多样性指数的影响

表4 新产玉米对肉仔鸡盲肠α多样性指数的影响

2.3 新产玉米对肉仔鸡回肠和盲肠微生物的影响

通过对肉仔鸡回肠和盲肠微生物门水平序列分类鉴定总共发现了44个菌门。其中对照组与处理组回肠中的优势菌门分为Firmicutes（96.48%、77.46%）和Proteobacteria（3.55%、8.95%）（图2a），盲肠的优势菌门为Firmicutes（68.08%、88.56%）和Proteobacteria（29.14%、7.21%）（图3a）。在属水平上，肉仔鸡回肠和盲肠总共鉴定出了531 个菌属。对照组与处理组回肠优势菌属为Lactobacillus（1.83%、58.19%），Rom⁃boutsia（19.61% 、2.16%）和Candidatus_Arthromitus（1.73%、4.41%）（图2b），盲肠优势菌属为Escherichia-Shigella（2.66%、2.87%），Faecalibacterium（4.94%、12.52%）和Lachnoclostridium（6.08%、7.91%）（图3b）。

图2 回肠物种丰度分布柱状图门水平（a）属水平（b）

图3 盲肠物种丰度分布柱状图门水平（a）属水平（b）

2.4 细菌群落组成差异

回肠门水平上微生物相对丰度结果见表5。表5可见，与对照组相比，处理组显著降低了Firmicutes的相对丰度（P＜0.05），显著增加了Proteobacteria 和Acti⁃nobacteria的相对丰度（P＜0.05）。在属水平上，处理组显著增加了Lactobacillus 的相对丰度，显著降低Fae⁃calibacterium 的相对丰度（P＜0.05）。而在盲肠门水平上（表6），Firmicutes 和Proteobacteria 的相对丰度与回肠相对丰度呈相反的趋势，处理组Firmicutes 的相对丰度显著高于对照组，Proteobacteria 相对丰度显著低于对照组（P＜0.05）。在属水平上（表6），处理组盲肠Lactobacillus、Faecalibacterium相对丰度显著高于对照组（P＜0.05），Romboutsi 相对丰度显著却低于对照组（P＜0.05）。此外，使用加权的Unifrac 矩阵距离的β多样性分析结果通过聚类分析发现，处理组和对照组间群落组成差异较大（P＜0.05）（图4）。

表6 新产玉米对盲肠微生物门、属相对丰度的影响

图4 回肠和盲肠微生物主坐标轴分析（PCoA）回肠微生物PCoA（a）盲肠微生物PCoA（b）

3 讨论

3.1 饲粮添加新产玉米对肉仔鸡生长性能的影响

玉米由于其粗蛋白和粗纤维含量较低，同时适口性好、消化率高，常被用作为肉仔鸡养殖中最主要的能量饲料，通常在畜禽饲料配方中占比高达50%～70%。因此玉米品质的好坏将会直接对肉仔鸡生产产生较大的影响。本试验研究发现添加60%新产玉米显著降低了前期和后期肉仔鸡平均日增重，提高了料重比，这与前人研究结果类似[11]。新产玉米当中存在较多的抗性淀粉，在储存一段时间之后，玉米当中的抗性淀粉含量会降低，随着新产玉米添加比例的上升，饲粮当中所含抗性淀粉含量同时也会上升[12]，因此导致肉仔鸡平均日增重下降、料重比增加的原因可能是新产玉米熟化不完全所致。Yin[13]研究发现，饲粮添加新产玉米会显著降低肉仔鸡的料重比。在本试验中，肉仔鸡料重比随着添加比例的增加呈现出上升的趋势，且试验Ⅰ组新产玉米添加组显著高于处理Ⅲ组，这说明新产玉米添加比例越高，生产水平越差。肉仔鸡是“为能而食”动物，通常是通过增加饲料采食量或摄入量来满足机体对能量的需求，本试验中也观察到此现象，但各组间采食量差异不显著，同时也说明肉仔鸡通过增加采食量来改善生长性能的调节能力有限。因此在新产玉米使用过程中，应该合理控制好添加量，以抵御新产玉米带来的负面效应。

3.2 饲粮添加新产玉米对肉仔鸡回肠、盲肠微生物区系的影响

认识新产玉米对肉仔鸡肠道微生物群落的影响，对于解析新产玉米对肉仔鸡生产性能和肠道健康造成负面影响的机制，合理利用新产玉米、提高养殖收益具有重要意义。田亚东等[14]研究结果表明，肉仔鸡肠道微生物多样性及细菌群落会受到饲喂饲料来源的影响，其中玉米饲粮组较大米饲粮组微生物多样性低，优势菌群高。本试验分析发现处理组显著增加了肉仔鸡盲肠Simpson 指数，且其盲肠和回肠Shannon指数、Chao1 指数也均呈现出高于对照组的趋势，这说明新产玉米使得肉仔鸡肠道微生物结构更加趋于多样化。通常情况下，微生物越趋于多样化越有益于机体健康，也被认为是肠道微生物群落成熟的标志[15-16]。但是多样化的微生物区系并不一定对机体健康有利[17]，有研究结果表明，高度多样化的微生物群落结构会对机体发育产生不良影响[18-19]。

本试验与前人研究结果基本一致[20-21]，Firmicutes、Actinobacteria和Proteobacteria是处理组和对照组回肠和盲肠的优势菌门。Proteobacteria常被当做肠道稳态失调和疾病诊断的潜在标志菌[22]。而Actinobacteria是导致过度肥胖、炎症性肠炎（IBD）和肠易激综合征（IBS）等疾病肠道中的主要优势菌[23]。Firmicutes 的代谢产物主要是短链脂肪酸，短链脂肪酸的主要功能是参与胆固醇的合成，降低肠胃pH 值，抑制病原菌的生长[24]。另外有研究表明肠道中Firmicutes的丰度减少，Proteobacteria 的丰度增加，会对机体健康产生不良影响[25]。在本试验中，处理组回肠Firmicutes丰度显著低于对照组，Proteobacteria 高于对照组，表明新产玉米对肉仔鸡回肠产生了不良影响，这与之前研究结果一致[2]。而处理组盲肠Firmicutes 丰度显著高于对照组，Proteobacteria 显著低于对照组，这与前人研究结果不一致，推测可能原因与盲肠中某些特定的菌群影响有关，但是具体原因还有待开展进一步研究。有研究结果表明，盲肠某些特定菌会产生对其他菌种有拮抗或促进作用的物质，例如细菌素和有机酸等[26-27]。Lactobacillus 是人们普遍认为的益生菌，它能通过激活细胞分裂蛋白激酶（MAPK）,诱导细胞凋亡和调节上皮细胞抗炎症反应，往往Lactobacillus 的数量与抗炎症反应呈正相关[28]。关于Faecalibacterium的研究比较多，通常被认为与其慢性肠炎、IBS和节段性肠炎的发生相关[29]。有研究结果表明，在肠激综合征患者体内，Faecalibacterium 的表达水平较低，而在节段性肠炎患者体内Faecalibacterium 的表达水平较高[30]。也有研究结果显示肉仔鸡肠毒综合征的原因之一是由于肠道菌群失调所致[31]。在本试验中处理组改善了回肠Lactobacillus的丰度，降低了Faecalibac⁃terium的相对丰度；增加了盲肠Lactobacillus和Faecal⁃ibacterium 的相对丰度，表明新产玉米在一定程度上对肉鸡回肠和盲肠均有损害作用，并且会导致肉鸡肠毒综合征或其他肠道疾病的发生，同时处理组中Lac⁃tobacillus丰度升高，也侧面说明新产玉米可能与肠上皮炎症反应加剧有关。Romboutsia与人类健康息息相关，Mangifesta[33]比较了结直肠癌患者与健康人肠道微生物数量之后，发现Romboutsia 在健康肠道中含量较高，而在结直肠癌患者组织内丰度显著降低[32]。另外Romboutsia 还可以利用其他微生物释放的宿主源糖，表明Romboutsia 依赖于黏液降解微生物。本试验发现新产玉米降低了Romboutsia 的丰度，在一定程度上说明，新产玉米对肉仔鸡盲肠微生物区系也有负面影响，主要与微生物释放的宿主源糖对Romboutsia 的影响密切相关。

4 结论

在本试验条件下，随着饲粮中新产玉米添加比例的提高，肉仔鸡生长性能有下降趋势，含60%新产玉米饲粮肉仔鸡体增重显著降低，料重比显著提高，且回肠中Proteobacteria、Actinobacteria 和Lactobacillus 显著增加，盲肠中Firmicute、Lactobacillus和Faecalibacte⁃rium菌丰度显著增加，并且对肠道微生物区系产生了不良影响。