川乌、白芍治疗类风湿关节炎的网络药理学研究

樊梅 唐芳 马武开 兰维娅 李宇 蒋总 蔡鑫 金泽旭

【摘 要】目的：研究川烏、白芍治疗类风湿关节炎的作用机制。方法：以口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18为指标，通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）数据库分别获取川乌、白芍的活性成分、作用靶点，GeneCards数据库获取类风湿关节炎靶点，采用Cytoscape 3.7.2软件构建川乌、白芍活性成分?作用靶点网络，采用蛋白质相互作用数据库（String 10.0）构建蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络，最后通过基因本体论（GO）及京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析川乌、白芍防治类风湿关节炎的作用机制。结果：共得到川乌、白芍97个活性成分，涉及1041个作用靶点，通过筛选得出16种活性成分，检索到类风湿关节炎靶点3797个，其中川乌、白芍和类风湿关节炎的共有靶点34个，参与的KEGG通路有AGE-RAGE、白细胞介素（IL）-17、肿瘤坏死因子（TNF）、Toll样受体、p53、叉头框转录因子O（FOXO）、JAK-STAT、活化PI3K-Akt、核转录因子-κB等信号通路。结论：川乌、白芍可能通过IL-6、蛋白激酶、丝裂原活化蛋白激酶等靶点作用于AGE-RAGE、IL-17、TNF、Toll样受体、p53、FOXO等等多项细胞因子及多条信号通路发挥治疗类风湿关节炎的作用，提示川乌、白芍多成分、多靶点、多途径的特征，对未来研究川乌、白芍治疗类风湿关节炎具有重要意义。

【关键词】 类风湿关节炎;川乌;白芍;网络药理学;信号通路

Network Pharmacology of Chuanwu and Baishao in the Treatment of Rheumatoid Arthritis

FAN Mei，TANG Fang，MA Wu-kai，LAN Wei-ya，LI Yu，JIANG Zong，CAI Xin，JIN Ze-xu

【ABSTRACT】Objective：To study the mechanism of Chuanwu（Radix Aconiti）and Baishao（Radix Paeoniae Alba）in the treatment of rheumatoid arthritis.Methods：According to the indexes of OB≥ 30% and DL ≥ 0.18，the active components and targets of Chuanwu and Baishao were obtained by TCMSP database，and the rheumatoid arthritis targets were obtained by GeneCards database，software 3.7.2 was used to construct the protein-protein interaction（PPI）network，and finally，the mechanism of them in the prevention and treatment of rheumatoid arthritis was analyzed by Gene Ontology（GO）and Kyoto Encyclopedia of genes and genomes（KEGG）pathway enrichment.Results：A total of 97 active components of Chuanwu and Baishao were obtained，involving 1041 targets.Through screening，16 active components were obtained，and 3797 targets of rheumatoid arthritis were retrieved，including 34 targets of Chuanwu，Baishao and rheumatoid arthritis.

AGE-RAGE，IL-17，TNF，Toll-like receptor，p53，FOXO，JAK-STAT，activation of P13K-Akt，nuclear factor-κB and other signaling pathways involved in KEGG.Conclusion：Chuanwu and Baishao may be related to IL-6 and protein kinase，mitogen activated protein kinase and other targets act on AGE-RAGE，IL-17，TNF，toll like receptor，p53，FOXO and other cytokines and multiple signaling pathways to play a role in the treatment of rheumatoid arthritis，suggesting that Chuanwu and Baishao have the characteristics of multi-component， multi-target and multi-channel， which is of great significance for the future study of Chuanwu and Baishao in the treatment of rheumatoid arthritis.

【Keywords】 rheumatoid arthritis;Chuanwu;Baishao;network pharmacology;signal pathway

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种慢性全身性自身免疫性疾病，以侵蚀性、对称性关节炎为特征，导致关节疼痛和功能丧失，是世界范围内致残的主要原因之一，其基本病理改变为滑膜炎及血管翳形成，发病机制目前尚不甚明了[1]。RA的治疗主要依赖于改善病情抗风湿药（DMARDs）、非甾体抗炎药、糖皮质激素、中草药和生物制剂等。中草药治疗RA历史悠久[2]，具有多成分、多靶点、多途径和注重整体的优点，治疗作用明显[3]。

RA属中医学“痹证”范畴，年老体虚、正气不足，风寒湿邪气乘虚入里，痹阻关节筋脉是引起RA的主要病机。中医治疗RA所用的中药较多[4]，白芍药用部位为毛茛科植物芍药的根，有养血敛阴、柔肝止痛、平抑肝阳等功效，主要用于治疗疼痛病症，白芍总苷为白芍的主要成分，能抗炎、镇痛及免疫调节[5]。川乌为毛茛科植物乌头的干燥母根，中医学认为，其能祛风除湿，可用于风寒湿痹、关节疼痛、麻醉止痛等，是中医临床的常用药[6]。川乌、白芍配伍最早见于汉·张仲景《金匮要略》的乌头汤，是治疗风寒湿痹证常用的药对[7]，现在多用于治疗RA，临床运用广泛;但其药效基础及具体作用机制尚未明确，限制了其临床运用。因此，鉴于川乌、白芍有效成分的复杂性与多样性，本研究采用网络药理学方法，研究川乌、白芍治疗RA的药理机制建立了药物与疾病间的网络，以期为进一步利用川乌、白芍治疗RA提供一定依据。

1 材料与方法

1.1 川乌-白芍化学成分的获取与活性成分的筛选 从TCMSP数据库（http：//www.tcmspw.com/tcmsp.php）中分别获取川乌、白芍的化学成分，共搜集97个化合物。

1.2 口服生物利用度（OB）和类药性（DL）筛选 在TCMSP数据库中对川乌、白芍所有成分数据库进行筛选，主要以OB和DL为筛选条件。

1.3 药物靶点转换和疾病靶点的筛选 通过UniProt数据库（https：//www.uniprot.org/）将所得药物靶点ID转换成GeneCards数据库（https：//www.genecards.org/）的基因名称。以“rheumatoid arthritis”作为关键词，在GeneCards数据库收集和RA相关的基因。通过对RA相关基因和川乌-白芍靶基因的定位，获得川乌、白芍治疗RA的靶点。

1.4 活性成分-靶点网络构建 将上述步骤所得的共同靶点，利用Cytoscape 3.7.2软件，构建川乌-白芍药对成分靶点-靶点群网络，化合物节点度（degree）表示治疗RA的化合物个数，重点对度值较大的化合物进行分析。

1.5 蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络构建 为了说明靶点蛋白在系统水平上的作用，将川乌-白芍与RA共同靶点基因，上传到在线String 10.0软件（https：//string-db.org/），选取分值 > 0.4的最高置信度数据，构建由导入基因所表达产物组成的PPI网络，并且利用R语言3.6.1软件（https：//www.r-project.org/），绘制PPI网络中蛋白质绘的条形图。

1.6 基因本体论（GO）及京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析 通过DAVID数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）对PPI网络中的蛋白质进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，以阐明化合物的靶点蛋白，对基因功能及信号通路的影响。

2 结 果

2.1 活性化合物的筛选 选取TCMSP数据库中OB≥30%、DL≥0.18的化合物，共筛选出16个活性化合物，如芍药苷（paeoniflorin）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）、山柰酚（kaempferol）、儿茶素（catechin）等。

2.2川乌、白芍活性成分-RA靶点相互作用韦恩图 依据Z值 < -1.0标准，按分子-靶蛋白对接结果中筛选出相关靶蛋白，利用UniProt数据库转换成对应的基因名称，结果共发现34个共同基因，确定为川乌、白芍治疗RA的靶基因。见图1。

2.3 川乌、白芍活性成分-靶点相互作用网络 通过Cytoscape 3.7.2建立川乌、白芍-RA的网络。该网络由40个节点，4个目标节点，34个疾病节点和82个边缘组成，其中红色节点代表RA，紫色节点代表川乌、白芍，黄色节点节点代表川乌、白芍药物活性成分，蓝色节点代表RA靶点，每条边代表川乌、白芍与RA之间的相互作用关系。见图2。其主要化合物有芍药苷（paeoniflorin）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）、山柰酚（kaempferol）、儿茶素（catechin）。

2.4 靶点PPI网络、关键基因分析 PPI网络由34个靶蛋白节点和225条相互作用的线组成。见图3。其中白细胞介素（IL）-6（度值 = 27）、蛋白激酶（Akt1，度值 = 25）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK8，度值 = 23）、胱天蛋白酶3（CASP3，度值 = 22）、JUN（度值 = 22）等具有较高的度值，它们与其他蛋白相互作用，并在网络中起重要作用。见图4。

2.5 GO生物过程分析 在DAVID数据库中，34个目标基因在GO生物过程中富集，根据错误发现率（FDR）< 0.05筛选出65个GO生物过程，见图5。可见RA的发生、发展涉及蛋白质活性、肿瘤坏死因子（TNF）活性、DNA和RNA转录调控等生物过程，川乌、白芍可通过调控上述生物过程来治疗RA。

2.6 KEGG信号通路分析 利用DAVID数据库，将川乌和白芍的34个靶基因富集到KEGG信号通路中，并以FDR < 0.05为筛选条件，得出与RA密切相关的信号通路。包括AGE-RAGE、IL-17、TNF、Toll样受体、p53、叉头框转录因子O（FOXO）、JAK-STAT、pI3k-Akt、核转录因子-κB（NF-κB）等115条信号通路，每条通路都有相应的通路图。推测川乌、白芍可能主要通过调控上述关键基因，通过影响上述信号通路达到治疗RA的作用。

3 讨 论

RA是一种进行性关节损害的慢性炎症性疾病，女性发病率高于男性，主要见于老年人，可导致进行性残疾、过早死亡和增加社会经济负担，对称性关节受累的临床表现包括关节疼痛、肿胀、发红，甚至限制运动范围，除关节症状外，还可导致外部或内脏损害，如类风湿结节、心、肺、肾、周围神经和眼睛等[8]。目前，RA常用的治疗方法有手术治疗、药物治疗和心理治疗等，中医药在临床上亦有特殊的治疗作用[9]。中医药具有多化学成分、多药理作用和多作用靶点的特点，传统的研究方法难以完全解释其作用机制。近年来，由生物信息学和药理学相结合而产生的网络药理学可以清楚地阐明这类药物的作用原理，系统解释多组分药物在疾病治疗中的作用，通过找出药物组分及靶点与疾病的关系，并将其抽象为网络关系模型[10]。因此，笔者采用网络药理学方法研究川乌、白芍对RA的治疗作用，以期找到其药用价值。

本研究中，RA与川乌、白芍相关的活性成分-潜在靶点网络中包含34个靶点，其中，度值 > 20的靶点为IL-6、Akt1、MAPK8、CASP3、JUN、PTGS2、CAT，推测川乌、白芍有效成分可能通过上述靶点发挥作用。如PTGS2基因参与NF-κB信号通路的调控，在滑膜炎症中具有很大的作用，调控炎症、凋亡、免疫反应以及细胞因子与趋化因子的级联反应等，参与破骨细胞及成骨细胞的生成和分化[11];IL-6作为一种多向性细胞因子，已被证明与RA的发病机制密切相关[12]。

通过初步筛选，得出川乌、白芍治疗RA的活性成分主要有4种，即芍药苷、β-谷甾醇、山柰酚、儿茶素。研究表明，芍药苷能改善RA相关通路上的炎症、代谢和免疫反应等，可作为治疗RA的潜在药物[13];β-谷甾醇是植物和蔬菜的主要成分，具有多种生物学效应，可调节巨噬细胞的功能，有望成为RA治疗的有效药物之一[14];一项分子对接研究表明，山柰酚可以通过相关通路抑制RA成纤维样滑膜细胞的增殖和迁移，从而抑制活化的T细胞介导的炎性细胞因子如IL-17、IL-21和TNF-α的释放[15];儿茶素可以不同程度地干扰IL-1β信号通路的表达，从而发挥抗炎的作用[16]。

从通路富集结果分析可知，川乌、白芍主要通过影响以下通路发挥治疗RA的作用：AGE-RAGE、IL-17、TNF、Toll样受体、p53、FOXO、JAK-STAT、pI3k-Akt、NF-κB等115条信号通路。如AGE-RAGE信号通路在骨骼中有一定的作用，包括增强成骨功能[17];IL-17或TNF-α均能处理RA滑膜细胞，上调基质金属蛋白酶的表达，参与滑膜细胞的迁移、侵袭及关节破坏[18];IL-17在RA成纤维样滑膜细胞中增加Toll样受体的表达[19];研究发现，p53具有控制炎症反应的新功能，因此，干扰p53通路是治疗RA的有效策略[20];FOXO基因的转录失调可能与RA的发病机制有关[21];JAK-STAT信号通路[22]、PI3K-Akt信号通路[23]、NF-κB信号通路[24]等与RA这种炎症性和自身免疫性疾病的发病机制亦密切相关。

综上所述，本研究采用网络药理学方法对川乌、白芍活性成分、作用靶点、作用通路进一步探讨，发现川乌、白芍中的芍药苷、β-谷甾醇、山柰酚、儿茶素等成分可能通过IL-6、Akt1、CASP3、PTGS2等靶点作用于AGE-RAGE、IL-17、TNF、p53、FOXO、JAK-STAT、PI3K-Akt、NF-κB等信号通路发挥治疗RA的作用，川乌、白芍多靶点、多通路治疗RA的机制得到初步验证，可为下一步研究提供参考;但川乌-白芍药对治疗RA复杂的机制，还有待进一步试验验证。

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收稿日期：2020-10-18;修回日期：2020-11-25