水性组织透明化技术的研究进展与应用

吴昊妍 詹琰静 张士文，2

0 引言

机体由不同的组织和器官构成，并借由器官间的互相协作来完成生命活动。因此，了解器官和组织的精细结构对于进一步明确生命代谢机制及疾病的发生发展有重要作用。此外，发育生物学需要研究者在三维空间下理解组织器官的生长发育。因此，随着显微成像技术的应用，组织器官的三维成像受到了广泛的关注。

目前显微成像技术虽然极大地增加了成像深度，但对于较厚组织深部结构的观测仍旧有限。如电子计算机断层扫描，虽然其可以对体积较大的组织进行完整成像，但它们空间分辨率较低，无法实现单细胞的成像，且成像深度有限。除此之外，组织中的色素会吸收可见光进而阻挡入射光和激发光，组织的内源性荧光或在样本操作过程中所产生的荧光信号会干扰组织观测，半透明或乳白色的生物组织外观也会使图像信噪比降低而影响深部成像。为解决成像深度的问题，组织透明化技术应运而生，它可在一定程度上降低组织的散射率并缓解组织光吸收。

目前，许多科研工作者致力于探索和改进各种透明化方法，如iDISCO、uDISCO、PEGASOS及CUBIC、PACT、ScalsS(2015)、Ce3D等，以期获得一套全组织高分辨率(至少细胞级分辨率)成像的解决方案。组织透明化技术有多种分类方法，本文按照主流分类方法将其分为油性透明化技术和水性透明化技术，并对水性透明化技术的被动浸润法、水化法和水凝胶嵌入法三类方法进行综述。

1 被动浸润法水性透明化技术

被动浸润法水性透明化技术是指将组织浸泡在高折射率(>1.45)溶液中并置于适宜的温度下孵育，利用渗透压使组织逐渐透明化。该方法不去除脂质，利用高折射率溶液替换组织内外的液体，以平衡折射率。此法常应用于较小样本的透明化处理。目前报道的被动浸润法水性透明化技术主要有以下几种。

1.1 ClearT/ClearT2、ReagentTF

ClearT/ClearT2是Kuwajima 等[5]为了更好地观察小鼠的神经元及非神经元组织，发明的基于甲酰胺的组织透明化方法，通过组织透明化技术结合光学成像来观察脑部结构及全脑的神经网络是研究脑组织的重要手段。此技术结合组织标记技术可成功地对小鼠胚胎及幼鼠的大脑进行成像。

ClearT成像效果好，速度快，并能与脂溶性示踪剂和荧光示踪剂兼容。但该法会使样本略微膨胀，且会使样本荧光信号淬灭。聚乙二醇 (polyethylene glycol，PEG)可以稳定蛋白质构象，继而发展了可保留免疫组化和基因编码的荧光蛋白的ClearT2技术，但其组织透明度比ClearT低，透明化能力受限，无法处理幼鼠全脑或成年鼠脑组织。

ReagentTF是汪建茹等[6]在ClearT基础上引入三乙醇胺试剂，发展的能与多种标记方法兼容的技术。其操作更简便，成像更好，对样本结构的保护效果更优，解决了ClearT2处理样本后荧光信号随着时间减弱的缺点，更好地保持了样本荧光信号甚至有所提升。通过ReagentTF技术，可清晰观测到树突棘和轴突等精细结构，实现神经环路的可视化，并进行神经元的长程投射追踪。

1.2 SeeDB、UbasM、FRUIT

Ke等[7]发明了SeeDB(see deep brain)技术，它以果糖和0.5%α-硫代甘油饱和溶液为主要成分，能在几天内将样本透明化。经SeeDB处理的脑切片样本能有效透明化大脑灰质和白质，且样本完整性好，体积变化小。其可以与免疫组织化学结合，并与亲脂性示踪剂细胞膜红色荧光探针(DiI)兼容，有助于脑部神经回路的研究。SeeDB因高浓度果糖黏度大导致其在组织内的渗透性较低。即使动脉灌注可以促进SeeDB在脑部的扩散，但其极高的黏度使其很难应用于较大的哺乳动物。通过加热至50℃可以增加其渗透性，但由于美拉德效应导致褐变和自荧光积聚，荧光蛋白淬灭，从而影响样本的透明化。

SeeDB用于研究脑部神经回路，因此可以利用其研究死后大脑样本中的神经元连接。目前也有学者利用SeeDB实现眼内结构的可视化[8]，对眼睛进行定性定量研究。

Chen等[9]发现二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)具有很好的化学促渗功能，在SeeDB的基础上加入DMSO加速试剂进入组织，以提高透明化效率。该技术被命名为UbasM，可在1 h内处理1 mm脑切片，7 d内实现小鼠半脑透明化，还可使心脏、肝脏等透明化，其中对肠的透明化速率是最快的。在疾病研究方面，UbasM不仅可以结合免疫荧光技术应用于老年痴呆的研究，还可以结合共聚焦显微镜对带有荧光标记的肿瘤细胞及组织器官进行观察。

由于SeeDB黏度极高，Hou等[10]在SeeDB基础上衍生了一种透明化方法FRUIT。该法选择尿素作为试剂中另一主要成分，降低了果糖黏度，大大提高试剂流动性和渗透性，加速了试剂在组织中的扩散速率，可结合动脉灌注实现较大哺乳动物的全脑透明化。

1.3 TDE

TDE是Staudt等[11]开发出的一种可改变折射率以适用所有油镜镜头的低成本、低毒性的透明化技术，此技术可解决成像组织与油镜的折射率不匹配导致成像效果降低的问题。TDE在脑组织中的扩散速度快，可在数月内保存荧光蛋白，而且不会引起组织变形。其不仅实现了小鼠大脑和人脑组织的透明化，还实现了对植物组织拟南芥生殖细胞的透明化。

由于TDE在高浓度时会降低荧光强度，限制成像深度，将来的发展方向主要是针对于增加样本透明化深度，并扩大除脑组织外对于其他组织器官的应用。

1.4 FocusClear

FocusClear 是Liu等[12]发明的透明化技术。其以昆虫蟑螂大脑为实验样本，采用二乙酰胺基三碘苯甲酸作为主要透明化试剂，提高了组织结构的图像分辨率，辅助共聚焦显微镜可观察细胞间的相互作用，并且能与荧光染色剂和基因绿色荧光蛋白兼容。除此之外，FocusClear的透明化过程可逆，操作时可以将样本置于PBS中保存或继续处理。FocusClear目前用于昆虫脑的研究，但对于较大的样本来说，成本昂贵，且不能针对不同的生物样本进行改进优化。

2 水化法水性透明化技术

水化法水性透明化技术是指在透明化过程中被动去除脂质后，利用水合作用降低样本折射率进而实现组织透明化。此方法中，透明化试剂中的尿素或甲酰胺可渗透进入高折射率的蛋白质并使整体折射率降低。

2.1 Scale / ScaleS

Hama等[13]研发了Scale透明化技术。在尿素中混合甘油和Triton X-100制成Sclae A2试剂，在加快渗透速度的同时可完整保留标记细胞的荧光信号，对于重建组织细胞群有重要意义。将试剂成分改性得到Scale U2可减少组织扩张及脆性，但其操作时间长，对较大样本的透明化效率较差。

Scale试剂不会导致荧光蛋白的淬灭，其材料易获得且成本较低，可应用于啮齿类、小型哺乳类、灵长类动物及人体活组织样本的成像。但此法操作时间较长，且易导致组织破碎，研究人员也根据这些特性对试剂成分比例进行不断调整改进[14-15]。

Hama等[16]在Scale A2基础上添加山梨醇制成改良试剂ScaleS，山梨醇可以使组织脱水收缩以中和由于尿素水化作用导致的样本体积膨胀。目前研究者们利用ScaleS对患阿尔兹海默病(Alzheimer disease，AD)或患AD死亡后的小鼠模型的大脑组织样本进行透明化，并对神经环路、淀粉样斑块、小胶质细胞等进行三维重建等研究。

2.2 CUBIC

CUBIC是Susaki团队[17]研发的一种新型水性透明化方法，其简单、有效，能完好保存荧光信号，并与脑组织的免疫染色兼容，结合显微成像技术能以单细胞分辨率进行全脑成像。其试剂基于Scale之上添加了氨基醇，它可以清除血红素使组织脱色，因此能通过灌注来加速组织渗透和脱色。

目前可利用CUBIC结合荧光蛋白观察神经细胞的轴突或突触连接，从而研究神经元连接，随着技术发展，其观察范围会从亚细胞结构扩展到灵长类动物的脑组织。此外，Kubota等[18]利用CUBIC在单细胞水平上描绘了癌症的转移，Fumoto等[19]则利用CUBIC结合转基因表达ZsGreen荧光蛋白完成了对肝脏及其他组织的观察，并成功观察了小鼠肝细胞内质粒DNA。

2.3 OPTIClear

人脑与啮齿动物大脑在理化性质、神经元组织等方面存在较大差异，并且不同人脑组织由于患者死前状态不同，在死后发生变化的不同从而导致不同人脑组织也存在差异，这些阻碍了人脑组织的透明化技术发展[20-21]。Lai等[22]研发了OPTIClear，先将脑标本用福尔马林液浸透，然后将脑标本在特定的温度下进行萤光漂染，再用OPTIClear 把脑组织透明化。OPTIClear选择性地调整组织的光学特性而不损坏或改变其结构成分。另外，他们发现福尔马林固定组织可以被甲酚紫和凝集素染色，帮助显示大脑神经元及血管的三维排布，从而不需要经过十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS)脱脂处理就可以进一步利用OPTIClear进行透明化。

2.4 Ce3D

为了解在复杂生理病理环境下不同器官细胞之间的结构功能关系，Gerner团队发明了Ce3D技术[23-24]。Ce3D处理的样本体积缩小但细胞形态完整，能与多种荧光蛋白和免疫标记兼容，可结合三维组织细胞术对不同类型的、高度混合的细胞群进行定量分析。

通过实验，可观察到Ce3D能对小鼠肺、肠、肝等组织及整段股骨进行有效透明化。除此之外，Gerner团队利用Ce3D成功透明化成像人体组织的活检样本。最近研究发现Ce3D与RNA转录本检测兼容，通过RNAscope检测方法结合Ce3D抗体染色，可以进行细胞表型分析及对厚组织中的RNA转录物进行高质量检测。Bossolani等[25]认为Ce3D是实现小鼠肠段快速3D成像的最有效方法，其能帮助显示胃肠壁内神经-免疫-血管交互网络中的不同细胞亚群。

3 水凝胶嵌入法水性透明化技术

水凝胶嵌入法水性透明化技术是将样本包埋在水凝胶中，使水凝胶与样本中的蛋白质和核酸分子形成共价连接以便固定和保护细胞结构，再将样本置于透明化试剂透明化试剂中，通过被动扩散或者电泳快速去除脂质，最后将样本置于高折射率溶液中进行透明化。

3.1 CLARITY

CLARITY是Chung等[26]发明的与传统水性透明化方法不同的组织透明技术。该技术通过将配置好的水凝胶溶液灌注入小鼠体内，使样本转变为刚性水凝胶状态，然后通过SDS对组织样本进行洗涤，最后采用电泳的方式将缓冲液中包裹脂质的SDS胶束从组织样本中去除。CLARITY在光学透明的基础上减少了荧光蛋白的淬灭，并且兼容大体积组织样本的免疫荧光标记。Zheng等[27]对水凝胶的配置进行了改进，添加了丙烯醛以提高组织结构的稳定性。Tomer等[28]、Yang等[29]和Zhang[30]团队都认为CLARITY的电泳步骤需要改进，他们将电泳改进为恒温摇床操作被动除脂，但透明速率的削弱可能会降低成像深度，所以即使电泳步骤会导致组织结构损伤及膨胀，但对于提高透明效率是必需的。

目前已有研究者将CLARITY应用于多种神经疾病的研究上，如自闭症患者的神经元细胞变化，灰质萎缩症的病因机制[31]， AD患者病变脑部Aβ、tau和神经丝的三维结构重建[32]，帕金森患者脑部死后病理状态，线粒体疾病中神经退行性变的机制[33]等。也有研究者将该技术应用于各种器官组织。Lee等[34]改良了CLARITY技术，将其应用于胰腺、肝等组织；Saritas等[35]借助其观察到饮食中钾元素缺乏会导致肾小管发生适应性变化； Cronan等[36]借助其揭示了分枝杆菌引起肿瘤病变的病理机制，还获得了肉芽肿瘤的三维可视化结构； Font-Burgada等[37]借助其成功发现并定位转基因小鼠肝脏中的HybHP； Greenbaum等[38]研发了Bone CLARITY技术，实现小鼠椎体和长骨骨干的三维重建，为骨骼疾病病理基础研究提供了新的思路。

3.2 PACT-PARS

为温和快速地使整个生物体透明化， Treweek团队[29，39]提出了PACT-PARS技术，他们使用了一种折射率耦合试剂，这种被动透明技术称为PACT，运用于全身细胞的技术称为PARS。Treweek团队优化了试剂，去除双丙烯酰胺，配置8% SDS透明化试剂，用持续心脏压力灌注取代ETC驱动，促进组织透明化并保存了荧光信号。

PACT-PARS技术可以应用于啮齿类动物的大多数器官及人体病理性活检组织，结合细胞免疫组化技术和荧光显微镜观察肿瘤细胞甚至亚细胞结构。Dabrowska团队[40]利用PACT-PARS技术研究了在癫痫发作时海马体到双侧皮质运动的神经通路状况，并探究了癫痫发作时神经传播路径及逆行性遗忘的病理机制。但PACT-PARS技术是利用生物体体内循环系统将试剂扩散到整个组织，由于各个组织血管网分布不均匀，所以不同器官透明化的程度和速度也不尽相同。

3.3 SHIELD

为实现组织的透明化，学者们往往会选择生物酶、化学物质、高温等方法，即使采用水凝胶保护生物大分子，也无法避免结构损伤。因此，Chung团队[41-42]发明了SHIELD透明化技术，通过环氧化物PP3E(polyglycerol-3-polyglycidyl ether)固定组织实现保护蛋白的作用，之后未采取丙烯酰胺凝胶包埋组织，而是使用SDS进行被动或主动除脂，最后对组织进行透明化，解决了组织结构和荧光蛋白的保护问题。借助SHIELD透明化技术，实现细胞水平的人脑组织块的透明化及对临床脑穿刺组织和单个神经元以及其周围突触簇的成像。

3.4 SWTICH

SWITCH是Murray等[43]研究的一种基于戊二醛(glutaric dialdehyde，GA)的新型透明化技术，GA不需要进行灌注即可渗透组织并形成均匀的组织凝胶，可应用于动物及人体的大型组织，且步骤简单。GA组织凝胶便于多轮免疫标记，在应用SDS高温脱脂后可实现组织样本的快速透明，并且可以高度保护内源性生物分子及其抗原性，保证结构完整性，使组织损伤达到最小化。Murray 团队利用SWTICH技术分析了人类皮质组合蛋白谱，并成功实现小鼠脊髓髓鞘的可视化。然而该技术仍存在一些问题，如用GA固定组织会导致广谱自发荧光的增加，由于mRNA在高温下不稳定，因此其与需要保留mRNA的方法不兼容，高温可能会导致组织褐变等。尽管SWITCH可以处理大样本，但标记速度仍然从根本上受到被动扩散的限制。

3.5 ACT-PRESTO

Lee等[44]开发了ACT-PRESTO技术来实现大型组织样本的快速处理，并与免疫标记兼容，可标记深层结构，操作简单易行，有利于增加临床上一些疾病的诊断速度。ACT-PRESTO技术分为两个部分，即ACT主动透明化技术及PRESTO促进大分子渗透的步骤，能于数小时至数天内完成组织透明化。Dai等[45]利用皮神经活检技术结合ACT-PRESTO实现了周围神经纤维的三维成像。

4 总结与展望

与传统的组织切片及二维成像技术相比，组织透明化技术实现了完整的组织或器官透明化，避免了组织切片对样本的扭曲，提高了成像效率，因此具有良好的应用前景。也可将此技术作为辅助方法用于疾病模型的诊断和建立。油性透明化技术由于需要脱水去脂，因此容易导致荧光蛋白的淬灭，而水性技术则可有效解决这一问题。

目前大多数水性透明化技术多应用于软组织的成像，对于硬组织的透明化研究及效果并不理想。除此之外，尽管透明化技术进一步加深了组织成像深度，但仍无法完美地应用于大体积样本，如人体组织器官的完整成像。因此针对大体积样本的透明化仍是一个需要攻克的难题。在未来，水性透明化技术应着重研究更先进的透明化试剂及方案以提高灵长类动物或人类组织器官的透明化效果，提升透明化速度的同时保留荧光蛋白，与脂溶性示踪剂和免疫标记技术兼容，增加抗体渗透速率和深度，从而完善免疫标记，实现器官组织亚细胞分辨程度上的快速成像。未来水性透明化技术可广泛应用于生物医学领域，为基础科学的疾病机制的研究提供思路，为疾病的诊断提供精准的病理学依据，为需要靶向治疗器官组织的定位提供帮助。