双相型真菌形态转化和致病机制的研究进展

付容 张振颖 侯彬彬

(1.大连医科大学,大连 116044； 2.香港大学深圳医院皮肤科,深圳 518053； 3.大连医科大学附属第二医院，大连 116021)

双相型真菌是一类特殊类型的致病真菌，在不同环境下具有不同的形态，其中温度是诱发其发生形态转换的一个中心因素，在室温条件下为以腐生方式生长的菌丝相，在37℃或人体中转化为具有致病能力的酵母相[1]。这种形态转换极有可能是其致病机制的关键。因此对双相型真菌致病机制的研究有利于这一类疾病的进一步防治。由菌丝相转换为酵母相的形态转化是双相型真菌具有致病能力的必备条件[2]。若人体通过吸入途径感染双相型真菌，可表现为呼吸系统症状甚至发展为威胁生命的全身性疾病，有报道每年世界范围内约150万人因感染双相型真菌而死亡[3]。双相型真菌主要包括皮炎芽生菌(Blastomycesdermatitidis)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasmacapsulatum)、粗球孢子菌(Coccidioidesimmitis)、巴西副球孢子菌(Paracoccidioidesimmitis)、马尔尼菲篮状菌(Talaromycesmarneffei)和申克孢子丝菌(Sporothrixschenckii)[4]。研究发现双相型真菌的致病机制是治疗和预防双相真菌病的关键，本文就双相型真菌致病机制进展的关键问题进行系统分析和综述。

1 双相性转化及其机制

双相型真菌的菌丝相生长在自然界中，生长温度在22～25℃之间，之后可产生雾化的分生孢子，大多数主要通过呼吸道侵入人体，在体温(37℃)的诱导下，其形态会发生变化，毒性增加，变为具有致病性的酵母相[1,5-6]。双相型真菌的形态转化是其致病的必备条件，该转化是一个复杂的过程，受信号转导和多种物质调控。

1.1 信号转导

在双相型真菌中，目前确定的与诱导37℃形态转化和酵母生长相关的信号传导途径主要是：①双组分信号传导；②异三聚体G蛋白和Ras信号传导。

双组分信号系统通过DRK1(二态性调节组氨酸激酶1)进行调节。DRK1基因是真菌由菌丝相转化为酵母相所必需的基因，首先在皮炎芽生菌中发现，其同源基因也存在于荚膜组织胞浆菌、巴西副球孢子菌和申克孢子丝菌内，在申克孢子丝菌中被命名为SsDRK1。DRK1基因编码一种混合组氨酸激酶，起着全面调节双相型真菌的二态性和毒力的作用，在感染的小鼠模型中，DRK1缺乏的双相型菌株在37℃仍然是菌丝体，不能转化为酵母相细胞，不具有毒性，这些菌株还表现出细胞壁完整性的缺陷，并且不能上调真菌酵母相特异性毒力因子[2,7]。目前研究已证明SsDRK1是申克孢子丝菌酵母相细胞形成、细胞壁完整性、黑色素的合成、形态发生相关基因Ste20的转录所必需的，是申克孢子丝菌致病所必需的物质，干扰DRK1基因的mRNA表达会导致真菌的菌丝和酵母相细胞生长延迟[8]。

Ras GTP酶控制多个过程，包括cAMP信号传导，形态发生、分化、细胞周期进程和真菌的致病基因表达。异三聚体G蛋白和Ras信号通路影响巴西副球孢子菌中的形态转化，菌丝体-酵母转换过程中诱导了异源三聚体G蛋白的α和β亚基，法尼基转移酶抑制剂(farnesyltransferase inhibitor)可抑制法尼基转移酶活性，使Ras蛋白不能被法尼基化修饰而不能结合于细胞膜，阻碍膜之间的信息交流，从而破坏了Ras蛋白的功能，促进了酵母菌向菌丝体的形成，逆转正常的形态转化。

1.2 热休克蛋白的调控

热休克蛋白(Hsp)是一类高度保守的蛋白质，具有多种调节功能，部分已经明确与双相型真菌的致病性有关，如真菌的形态转化、毒力等。热休克蛋白在真菌的致病性中起着主要作用，它参与调控真菌从土壤到宿主温度改变诱导的适应性反应。

Hsp60：具有强免疫原性，被认为是荚膜组织胞浆菌的抗原。在人体，Hsp60已被证明能够诱导荚膜组织胞浆菌素(从荚膜组织胞浆菌的细胞壁中提取出来的物质，具有丰富的免疫原性)反应的个体中的淋巴细胞增生[4]。其次，Hsp60是荚膜组织胞浆菌的酵母相细胞与宿主吞噬细胞表面CD11b/CD18(CR3)分子之间的主要细胞识别配体，凸显出它在真菌致病机制中的重要性[4]。

Hsp70：双相型真菌菌丝相向酵母菌相过渡的早期，在最初的1 h中，荚膜组织胞浆菌的Hsp70 mRNA和Hsp70的含量迅速升高，随后大约6h又恢复到原水平，这意味着Hsp70可能与温度变化引起的热应激反应和细胞分化有关，可能只在该真菌对高温生长的最初适应阶段被需要[4]。

由于Hsp60和Hsp70具有强免疫原性，有研究者提出，它们是真菌致病时表达的重要蛋白质，是感染期宿主免疫反应的靶向目标，因此可作为真菌免疫疗法的潜在目标[4]。

Hsp90：存在于大多数双相型真菌的菌丝相细胞表面上，在巴西副球孢子菌中，Hsp90可以调节真菌的增殖和调节真菌体内活性氧(ROS)水平，并且可能协助酵母细胞适应各种生理压力，包括温度，宿主相互作用和氧化损伤。这样的机制通过钙调磷酸酶调节。研究显示，封闭Hsp90能抑制真菌酵母相细胞的生长，但是并不影响菌丝相细胞的发育。虽然Hsp90能调节巴西副球孢子菌的形态转化，但不是必需的调控物质[4]。

1.3 雌激素的作用

巴西副球孢子菌感染患者男性多于女性，研究证明雌激素能抑制真菌的形态学转换，也能调节宿主的细胞免疫，确切的机制尚不清楚[9]。使用微阵列技术对该现象进一步分析显示，在菌丝体向酵母相的转化过程中，雌二醇(E2)、细胞壁重塑、能量代谢和细胞信号传导之间存在相关性，当E2出现时，巴西副球孢子菌菌丝相细胞会改变高温诱发的正常细胞应答反应，改变随后的形态转化和致病机制[2]。

1.4 其他物质调控

除了以上的信号转导途径以外，还有多种物质参与调控真菌的生长、形态转化，糖鞘脂类物(glycosphingolipids，GSLs)是细胞膜的重要成分，分为中性和酸性GSLs，中性GSLs是合成真菌葡萄糖基神经酰胺(GlcCer)和半乳糖基神经酰胺(GalCer)的原料之一 ，破坏GlcCer合成能降低真菌的生长分化和毒力，干扰GlcCer合成的小分子物质有望成为抗真菌的新药；菌丝相真菌一个重要特点是极性生长，GSLs在真菌的极性生长中起着重要作用[3]。黏附素14-3-3是宿主与真菌抗原相互作用的基本物质，也参与了真菌的形态学转化，具体机制不清[2]。在马尔尼菲篮状菌中，rrtA基因编码了组蛋白乙酰转移酶(HAT)，这个酶与真菌的生长特别是菌丝相有关，参与DNA的修复，此基因的表达对真菌在应激反应时生命力的维持很重要。研究表明rrtA突变的真菌毒力下降，同时也干扰了真菌的形态转换[10]。多胺的合成与巴西副球孢子菌的形态转化有关，多胺是真核系统中细胞生长和分化所需的微分子，来源于鸟氨酸脱羧酶(ODC)使鸟氨酸脱羧的反应，在巴西副球孢子菌形态转换期间ODC的活性大大提高，促进多胺的合成，从而促使巴西副球孢子菌发生形态转换。ODC抑制剂1,4-二氨基-2-丁酮(DAB)能抑制其形态转换[7]。巴西副球孢子菌形态转换后，其细胞壁成分发生了变化，α-glucan是荚膜组织胞浆菌酵母相毒力相关的基本物质，它掩盖了真菌细胞壁的β-glucan层，阻碍了宿主受体PPR(dectin-1)对真菌的识别，从而逃避宿主的免疫防御系统[2,10]。粗球孢子菌在转化时，基因研究显示一些与细胞周期、细胞壁和应激反应相关中的蛋白激酶基因下调，这些基因的下调与粗球孢子菌小球形成之间的关系尚不清楚[6]。CPS1基因对粗球孢子菌的毒力也很重要，当删除此基因后，粗球孢子菌球体生长减慢，变为无毒体[6]。在双相真菌中，4-羟基苯丙酮酸双加氧酶(4-HPPD)基因表达均上调，该酶基因是酪氨酸分解代谢的基因复合体的一部分，4-HPPD酶降解有毒的羟基苯酮酸，破坏4-HPPD基因后，粗球孢子菌在巨噬细胞内不能生长和分化[6]。

2 免疫调控机制

双相真菌菌丝通过吸入途径进入终末细支气管和肺泡内，在此场所转换为酵母相，激活宿主的免疫反应，酵母相细胞被肺泡巨噬细胞和树突状细胞(DC)吞噬，酵母相细胞能适应巨噬细胞内恶劣的环境而繁殖，在感染急性期，酵母相细胞破坏巨噬细胞进入周围环境，播散至淋巴结和宿主其他器官，造成弥漫性的感染[11]。感染真菌后，机体的免疫防御特别是细胞免疫被启动，但由于真菌藏匿在巨噬细胞内，细胞免疫不能直接发挥细胞毒性作用将其杀灭，而巨噬细胞杀伤力不足以将其消灭，从而发生迟发型变态反应，真菌酵母相细胞被巨噬细胞包裹形成肉芽肿。肉芽肿的形成限制了真菌的复制和繁殖，IFN-γ、TNF-α能促进它的形成。在HIV患者和免疫被抑制的个体，由于真菌不能局限于肉芽肿内而发生播散，病情更加严重，更容易发生弥漫性的全身反应[11-12]。感染双相型真菌的临床表现严重程度取决于宿主的免疫力和真菌毒力的相互作用，当宿主免疫力强时，双相型真菌潜伏在体内，仅出现轻中度症状；当宿主免疫力弱时如免疫缺陷，真菌活跃，容易播散，侵袭呼吸道，甚至播散至全身导致多器官功能受损[4,9-10,13]。

2.1 黏附和入侵

双相型真菌进入呼吸系统后，表面的黏附素分子表达上调，有利于真菌定植在宿主细胞表面和播散至其他器官。在皮炎芽生菌的双相转化阶段，BAD1(芽生菌黏附素-1)基因是最常见的上调基因，促进组织黏附和逃避宿主免疫。在小鼠实验中观察到，真菌表面结合的BAD1通过与硫酸肝素和补体受体CR3结合而促进皮炎芽生菌酵母相细胞黏附到宿主细胞。除了促进黏附外，BAD1还能抑制细胞因子(TNF-α、 IL-17 、 INF-γ 等)产生和CD4+T淋巴细胞的激活而逃避宿主免疫系统损伤[7]。巴西副球孢子菌入侵宿主细胞时，表达了gp43、黏附素14-3-3和烯醇化酶等主要的黏附素，黏附在上皮细胞和内皮细胞等非吞噬细胞表面，诱导这些细胞摄取真菌和凋亡。gp43是巴西副球孢子菌表面的糖蛋白，是第一个被报道的黏附素，能诱导肺上皮细胞角蛋白降解，导致细胞凋亡，此外还能抑制宿主吞噬细胞的吞噬作用，促使真菌诱导宿主细胞骨架发生改变；黏附素14-3-3能增强巴西副球孢子菌的毒力，研究表明黏附素14-3-3缺乏的真菌毒力显著下降[2,10]。用蛋白质组分析已经确定了3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作是马尔尼菲篮状菌分生孢子表达的黏附因子[14]。

2.2 适应和抵御巨噬细胞的恶劣环境

进入宿主体内的双相型真菌的清除以细胞免疫为主，先天性固有免疫为辅。先天免疫系统细胞通过模式识别受体(PRR)如Toll样受体(TLR)、 核苷酸结合寡聚化结构域(NOD-)样蛋白和C型凝集素受体(CLR)识别真菌抗原，递呈给T淋巴细胞，使T淋巴细胞增殖活化为效应T细胞，产生Th1细胞因子如肿瘤坏死因子(TNF-α)和干扰素γ(IFN-γ)，导致巨噬细胞活化吞噬真菌，产生活性氧(ROS)和活性氮物质(RNS)杀死真菌或抑制生长。

巨噬细胞内是一个葡萄糖和氨基酸耗尽且缺氧的场所，且会产生许多ROS和RNS杀灭或抑制真菌的生长，然而许多双相型真菌已进化出在营养缺乏的环境中生存的防御机制。研究数据表明，在碳缺乏的恶劣环境下，巴西副球孢子菌酵母细胞利用β-氧化，三羧酸(TCA)和乙醛酸循环代谢提供的前提物质乙酰-CoA、丙酮酸、草酰乙酸和琥珀酸进入糖异生途径和合成乙醇，以此适应巨噬细胞内恶劣的环境[4]。真菌在巨噬细胞内化后，转录组分析显示，在碳饥饿压力下(碳饥饿6 h)，真菌运输生存所必需的营养物质(例如铜-己糖和单糖)的转运蛋白增加[2]。铁是真菌必需的微量元素，是生命活动所需的辅酶，巨噬细胞通过限制真菌摄取铁而抑制其增殖，然而在此环境下，真菌会改变能量代谢模式，变为非铁依赖的途径，降低磷酸戊糖途径中需铁酶的表达，抑制氧化磷酸化途径，提高糖酵解途径来代偿有氧途径的下降[14]。锌的摄取也很重要，在宿主体内，皮炎芽生菌的酵母相细胞会上调与外源性锌摄取有关的重要基因，包括PRA1、ZRT1、ZRT2，分别编码编码锌基团、高亲和力锌转运蛋白和低亲和力锌转运蛋白[7]。 CRISPR/Cas9基因编辑技术破坏皮炎芽生菌的PRA1和ZRT1基因后，其适应宿主恶劣环境的能力下降[15]。锌的摄取已被证明对另一种人类致病真菌白念珠菌的发病机制很重要，在白念珠菌中，PRA1结合被宿主隔离的细胞外锌，随后与高亲和力锌转运蛋白ZRT1相互作用，促进锌被摄入到真菌细胞内。

在宿主吞噬细胞内或在血管内，氧供是有限的，真菌必须要适应低氧和ROS环境。在巨噬细胞内H2O2强氧化剂下，双相型真菌能产生抗氧化剂如过氧化氢酶(CAT)、催化酶、细胞色素c过氧化物酶、硫氧还蛋白和超氧化物歧化酶等，并诱导新陈代谢转移至磷酸戊糖途径，细胞质中NADPH产量增加，为谷胱甘肽过氧化物酶系统提供电子来源，以恢复细胞氧化还原电位，随后酵母细胞在厌氧条件下将其用于生产ATP[2,16]。

聚酮化合物是一类由微生物合成的次级代谢产物，包括抗生素、真菌毒素和色素等，虽然这些次级代谢产物不是必需的，但具有生物活性，可以给微生物提供生存优势。黑色素属于聚酮化合物，在经历宿主酶的消化和严酷的酸性环境后，巴西副球孢子菌和马尔尼菲篮状菌等会产生大量黑色素，有助于酵母细胞的恢复，其次还能抑制巨噬细胞的作用，中和清除宿主效应细胞产生的氧自由基，从而增加真菌的毒力[2,7]。Mp1p是马尔尼菲篮状菌表面一种具有免疫原性的分泌甘露糖蛋白，在小鼠实验中证明，Mp1p在马尔尼菲篮状菌毒力中起着重要作用，它通过提高真菌在巨噬细胞中的存活而介导真菌的毒力，具体机制需进一步研究[14,17]。

除了巨噬细胞外，宿主的树突状细胞和中性粒细胞也参与对真菌的杀伤和清除。特别是在皮炎芽生菌感染个体中，中性粒细胞是引起脓性肉芽肿性炎症反应的主要细胞，需通过趋化因子募集到感染部位而发挥生理功能。最近研究报道，皮炎芽生菌酵母相细胞分泌的二肽基肽酶IVA(DPPIVA)能使趋化因子失活而调节宿主中性粒细胞的功能。DPPIVA是一种丝氨酸蛋白酶，能切割C趋化因子和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的N末端，从而使趋化因子失活，阻碍先天性免疫细胞的募集[7,18]。

2.3 真菌的播散

在感染的最后阶段就是真菌的播散，最近研究表明，真菌通过形成表面具有黏附素和水解酶的生物膜，黏附、侵袭和破坏宿主细胞和组织，这或许是真菌在宿主持续存在的重要原因。caspase-2、caspase-3、caspase-8能调节巨噬细胞和肺上皮细胞程序化死亡，便于真菌在体内的播散，此过程深受黏附素14-3-3和gp43的影响。

2.4 真菌细胞外囊泡的作用

真菌的细胞外囊泡(EV)类似哺乳动物的外泌体，是真菌分泌物质的途径，目前，EV已被认为是毒性因子跨细胞壁转运的重要结构，它能跨越真菌细胞壁，实现分子转运，这对真菌的营养获取、细胞防御有重要意义，甚至还能调节宿主的免疫防御。EV运载具有强免疫原性的α-Gal表位到细胞外，在荚膜组织胞浆菌和申克孢子丝菌中，这些细胞外的囊泡就像“毒力袋”一样。

从功能上讲，巨噬细胞分为两类，促进炎症的巨噬细胞被称为经典活化巨噬细胞(M1)，而抑制炎症和促进组织修复的巨噬细胞被称为交替活化巨噬细胞(M2)[19-21]。EV能促进巨噬细胞向“经典” M1表型分化，甚至能刺激巨噬细胞由M2表型转变为M1表型，被EV刺激过的巨噬细胞比IFN-γ激活的巨噬细胞具有更强的杀真菌活性[7]。另外，EV还参与从信号转导到细胞各种应激导致细胞分裂的各种复杂的生理功能。

2.5 其他影响真菌毒力的因素

基因学研究显示，粗球孢子菌中的9URA5基因失活能破坏嘧啶生物合成途径，尿嘧啶营养缺陷型酵母在巨噬细胞中失去毒力[10]。真菌氨代谢有关的酶对真菌毒力也很重要，在小鼠实验中证明，被感染组织是碱性的，粗球孢子菌合成脲酶和脲基乙醇酸水解酶，可将脲基乙醇酸酯降解为氨和乙醛酸(UGH)[6]。 脲酶和UGH基因敲除后的突变体产生的氨很少，即使在遗传易感的BALB/c小鼠中毒力也很弱，这表明真菌碱化环境的能力对其致病性很重要。

小结和展望

双相型真菌在自然环境中为菌丝相，吸入宿主后，在温度等多种因素作用下，变为酵母相，此过程称为双相型真菌的形态转化。双相型真菌致病机制是复杂多样的，其中双相型真菌的形态转化是其致病的重要条件，吸入宿主后酵母相细胞与宿主免疫系统相互作用，通过各种复杂调节机制展现其致病的过程，涉及到致病过程的多种分子物质有望成为抗双相型真菌的药物靶向目标，为其治疗提供了新思路。其次，双相型真菌细胞壁和细胞质中的具有强免疫原性的成分可以用于制备双相型真菌的疫苗，从而有效预防此病。