25-羟基维生素D3与维生素D3共晶对肉鸭生长性能、免疫功能及胫骨发育的影响

2021-04-13王昊宇刘延芬张克英丁雪梅白世平王建萍彭焕伟宿卓薇曾秋凤

动物营养学报 2021年3期

王昊宇刘延芬张克英丁雪梅白世平王建萍彭焕伟玄玥宿卓薇曾秋凤

(四川农业大学动物营养研究所，动物抗病营养教育部、农业部和四川省重点实验室，成都611130)

维生素D3是维生素D的一种活性形式，是调节动物体内钙吸收和骨骼形成的重要激素前体，在肝细胞内经25-羟化酶作用转化成为25-羟基维生素D3(25-OH-D3)，且25-OH-D3是维生素D在动物机体内的活性代谢物[1]。Bar等[2]指出，25-OH-D3和维生素D3都能被禽类肠道所吸收。Atencio等[3]研究表明，14日龄的雏鸡对25-OH-D3的吸收率(74.9%)高于对维生素D3的吸收率(66.5%)。在肉鸡生长过程中，25-OH-D3在提高胫骨粗灰分含量上的效果优于维生素D3[4]。当基础饲粮中含有较低水平的维生素D3时，添加25-OH-D3对肉鸡胫骨粗灰分含量的改进效果是维生素D3的2倍[5]。同时，在增重和降低肉鸡胫骨发育不良方面，25-OH-D3也有较好的效果[6]。Cantor等[7]发现，25-OH-D3还可改善肉鸡饲料转化效率，并提高胸肌重量。25-OH-D3价格较维生素D3高，基于成本考虑倾向于将25-OH-D3和维生素D3在饲粮中配合使用。因此，为提高25-OH-D3和维生素D3联合使用的效果，上海药物研究所研发出了一种新型的25-OH-D3和维生素D3共晶。维生素共晶是在低于任一种组成物熔点的温度下所有成分的融合，对比物理混合而言，维生素共晶具有结晶度高、吸湿性小的优点，并形成规整的晶体形态，稳定性增强，因而有利于提高其成药性能[8]。因此，本试验旨在通过研究25-OH-D3与维生素D3共晶对肉鸭生长性能、免疫功能及胫骨发育的影响，初步探讨25-OH-D3与维生素D3共晶在肉鸭上的作用效果，为新型饲料添加剂的研发提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验设计

25-OH-D3与维生素D3共晶中25-OH-D3与维生素D3比例为1∶1，又称骨化二醇共晶，由上海药物研究所提供。

试验采用单因素设计，选择360只1日龄樱桃谷肉鸭，随机分为3个组，每组6个重复，每个重复20只。T1组在基础饲粮中添加69.0 μg/kg 25-OH-D3与66.0 μg/kg维生素D3物理混合物(即为饲粮提供5 520 IU/kg维生素D3)，T2组在基础饲粮中添加135.0 μg/kg 25-OH-D3与维生素D3共晶(即为饲粮提供5 520 IU/kg维生素D3)，T3组在基础饲粮中添加67.5 μg/kg 25-OH-D3与维生素D3共晶(即为饲粮提供2 760 IU/kg维生素D3)。试验期35 d，分为1～14日龄和15～35日龄2个阶段。

1.2 试验饲粮及饲养管理

试验饲粮参照NRC(1994)和我国《肉鸭饲养标准》(NY/T 2122—2012)配制。基础饲粮采用玉米-豆粕型饲粮，其组成及营养水平见表1。试验于2019年7—8月在四川农业大学动物营养研究所试验场进行，网上平养，24 h光照。自由采食和饮水。前期采用红外灯给温，温控标准：1～3日龄30～32 ℃，4～7日龄28～30 ℃，以后每周降低2 ℃，直到24 ℃，并维持在24 ℃，其他管理按照常规进行。

1.3 样品采集与指标测定

1.3.1 样品采集

试验第14天和第35天称重后以重复为单位随机选取接近均重的肉鸭1只(n=6)。称量每只肉鸭宰前活重，颈静脉采血，静置后在4 ℃下4 000 r/min离心10 min，分离血清。另采集3 mL抗凝血，送到雅安市人民医院测定血常规指标，包括白细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸细胞和嗜碱细胞数目与百分率。采血结束后，颈静脉放血致死，剥离两侧胫骨，剔除附着的组织，4 ℃下保存用于后续测定。取左侧胸肌置冰箱4 ℃贮存24 h后测定肉品质，最后分离脾脏、胸腺、法氏囊和肝脏，并称重用于计算器官指数(器官重/活体重)。

1.3.2 指标测定

生长性能：在第1天、第14天和第35天以重复为单位记录肉鸭体重，称重前断料8 h，结算余料。计算平均日增重(ADG)和平均日采食量(ADFI)，根据ADG和ADFI计算料重比(F/G)。

屠宰性能及肉品质：测定肉鸭活体重、屠体重、半净膛重、全净膛重、鸭胸肉和腿肌肉重，测定方法参照NY/T 823—2004进行。测定鸭胸肉品质，包括肉色[亮度(L*)、红度(a*)和黄度(b*)值]、剪切力和滴水损失，测定参照席鹏彬等[9]的方法。

血清免疫球蛋白含量：血清免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)含量采用免疫比浊法进行测定，检测方法参照试剂盒说明书进行，试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

血清骨代谢指标：血清钙、磷含量及碱性磷酸酶(AKP)活性在四川农业大学动物营养研究所温江实验室用自动生化分析仪进行检测，采用甲基百里香酚蓝(MTB)比色法测定血清钙含量，采用磷钼酸法测定血清磷含量，采用4-氨基安替吡啉比色法测定血清碱性磷酸酶活性。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定血清甲状旁腺激素(PTH)和降钙素(CT)含量，血清抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)活性及骨钙素、Ⅰ型胶原C端肽(CTX-Ⅰ)含量使用ELISA试剂盒检测，试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

表1 基础饲粮组成及营养水平(干物质基础)

胫骨发育指标：采用WD-1型电子万能试验机测定骨强度，测定后于烘箱内105 ℃烘干后称量胫骨重量；粗灰分含量的测定参照GB/T 6438—2007；钙含量的测定参照GB/T 6436—2018；磷含量的测定参照GB/T 6437—2018。胫骨长度与宽度采用电子游标卡尺进行测量；宽度选取3个点测量结果取均值，精确到0.02 mm。将胫骨近端沿其顶部纵向切开，用电子游标卡尺测定生长板宽度和厚度，计算其指数和横截面积。

生长板宽度系数=生长板宽度/胫骨长度；
生长板厚度系数=生长板厚度/胫骨长度；
横截面积=生长板宽度×生长板厚度。

1.4 数据统计

试验数据采用SAS 9.2统计软件的一般线性模型(GLM)过程进行单因素方差分析，用LSD法进行多重比较。试验结果以平均值和均值标准误表示，以P≤0.05表示差异显著。

2 结果

2.1 25-OH-D3与维生素D3共晶对肉鸭生长性能的影响

如表2所示，与T1组相比，T2组肉鸭35日龄体重以及15～35日龄和1～35日龄ADG和ADFI显著提高(P<0.05)，但F/G无显著差异(P>0.05)；T3组肉鸭1～35日龄ADG和15～35日龄ADFI显著提高(P<0.05)。与T2组相比，T3组肉鸭生长性能指标均无显著差异(P>0.05)。

2.2 25-OH-D3与维生素D3共晶对肉鸭屠宰性能和肉品质的影响

如表3所示，与T1组相比，T2组肉鸭35日龄胸肌肉色L*值显著增加(P<0.05)，而其他屠宰性能和肉品质指标无显著差异(P>0.05)；T3组肉鸭屠宰性能和肉品质指标无显著差异(P>0.05)。与T2组相比，T3组肉鸭35日龄胸肌剪切力显著提高(P<0.05)。

表2 25-OH-D3与维生素D3共晶对肉鸭生长性能的影响

表3 25-OH-D3与维生素D3共晶对肉鸭屠宰性能和肉品质的影响

续表3项目Items组别 GroupsT1T2T3均值标准误SEM胸肌率 Breast muscle rate/%10.069.149.220.68腿肌率 Leg muscle rate/%14.6813.7613.430.76肉色 Meat color亮度 L*51.63a56.51b52.12ab1.87红度 a*9.298.799.540.84黄度 b*4.084.054.461.04滴水损失 Drip loss/%3.062.722.490.38剪切力 Shear force/N 4.74ab4.16a 4.82b0.23

2.3 25-OH-D3与维生素D3共晶对肉鸭免疫功能的影响

2.3.1 25-OH-D3与维生素D3共晶对肉鸭免疫器官指数的影响

如表4所示，与T1组相比，T2组肉鸭35日龄脾脏指数显著降低(P<0.05)；T3组肉鸭免疫器官指数无显著差异(P>0.05)。与T2组相比，T3组肉鸭14日龄法氏囊指数和35日龄脾脏指数显著提高(P<0.05)。

表4 25-OH-D3与维生素D3共晶对肉鸭免疫器官指数的影响

2.3.2 25-OH-D3与维生素D3共晶对肉鸭血常规指标的影响

如表5所示，与T1组相比，T2组肉鸭14和35日龄血常规指标无显著差异(P>0.05)；T3组肉鸭14日龄血液嗜酸细胞百分率和35日龄血液单核细胞计数显著增加(P<0.05)。与T2组相比，T3组肉鸭14日龄血液中性粒细胞百分率、单核细胞百分率、嗜碱细胞百分率以及单核细胞计数显著升高(P<0.05)，14日龄血液淋巴细胞百分率显著降低(P<0.05)；但35日龄血常规指标无显著差异(P>0.05)。

表5 25-OH-D3与维生素D3共晶对肉鸭血常规指标的影响

续表5项目Items组别 GroupsT1T2T3均值标准误SEM35日龄 35 days of age88.5358.5194.5328.82中性粒细胞百分率 NEUT percentage/%14日龄 14 days of age8.37ab7.12a9.63b0.7135日龄 35 days of age7.808.308.763.05淋巴细胞百分率 LYM percentage/%14日龄 14 days of age86.32ab89.80a82.43b1.4435日龄 35 days of age85.2381.2783.624.54单核细胞百分率 MONO percentage/%14日龄 14 days of age4.76ab 2.43a6.58b1.2435日龄 35 days of age0.700.931.150.23嗜酸细胞百分率 EO percentage/%14日龄 14 days of age0.47a0.62ab1.25b0.2935日龄 35 days of age0.440.290.320.12嗜碱细胞百分率 BASO percentage/%14日龄 14 days of age0.08ab0.03a0.10b0.0235日龄 35 days of age0.130.070.140.04中性粒细胞计数 NEUT count/(×109个/L)14日龄 14 days of age12.4311.019.972.9635日龄 35 days of age7.808.308.763.05淋巴细胞计数 LYM count/(×109个/L)14日龄 14 days of age119.90136.6089.1928.435日龄 35 days of age79.8449.3284.6028.77单核细胞计数 MONO count/(×109个/L)14日龄 14 days of age4.57ab2.36a5.30b0.9335日龄 35 days of age0.33a0.45ab0.72b0.11嗜酸细胞计数 EO count/(×109个/L)14日龄 14 days of age0.560.741.070.2435日龄 35 days of age0.440.290.320.12嗜碱细胞计数 BASO count/(×109个/L)14日龄 14 days of age0.090.110.080.0435日龄 35 days of age0.130.070.140.04

2.3.3 25-OH-D3与维生素D3共晶对肉鸭血清免疫球蛋白含量的影响

如表6所示，各组肉鸭14和35日龄血清免疫球蛋白含量无显著差异(P>0.05)。

2.4 25-OH-D3与维生素D3共晶对肉鸭胫骨发育的影响

2.4.1 25-OH-D3与维生素D3共晶对肉鸭血清骨代谢相关指标的影响

如表7所示，与T1组相比，T2组14日龄血清Ⅰ型胶原C端肽含量和35日龄血清钙含量显著升高(P<0.05)；T3组14日龄血清钙和降钙素含量显著降低(P<0.05)。与T2组相比，T3组14日龄血清降钙素含量和35日龄血清钙和Ⅰ型胶原C端肽含量显著降低(P<0.05)。

2.4.2 25-OH-D3与维生素D3共晶对肉鸭胫骨发育的影响

如表8所示，与T1组相比，T2组肉鸭35日龄胫骨粗灰分含量显著增加(P<0.05)；T3组肉鸭14日龄胫骨钙含量以及35日龄胫骨体积和胫骨粗灰分含量显著降低(P<0.05)。与T2组相比，T3组肉鸭14日龄胫骨粗灰分和磷含量以及35日龄胫骨钙含量显著降低(P<0.05)。

表6 25-OH-D3与维生素D3共晶对肉鸭血清免疫球蛋白含量的影响

表8 25-OH-D3与维生素D3共晶对肉鸭胫骨发育的影响

2.4.3 25-OH-D3与维生素D3共晶对肉鸭胫骨生长板发育的影响

如表9所示，与T1组相比，T2组肉鸭35日龄胫骨生长板宽度和宽度系数显著增加(P<0.05)；T3组肉鸭35日龄胫骨生长板厚度、厚度系数、宽度系数和横截面积显著增加(P<0.05)。与T2组相比，T3组肉鸭14日龄胫骨生长板宽度和宽度系数显著增加(P<0.05)。

表9 25-OH-D3与维生素D3共晶对肉鸭生长板发育的影响

续表9项目Items组别 GroupsT1T2T3均值标准误SEM宽度系数 Width index14日龄 14 days of age0.14ab0.13a0.15b0.0135日龄 35 days of age0.12a0.13b0.13b0.01横截面积 Cross-sectional area/mm214日龄 14 days of age20.9517.8221.222.1035日龄 35 days of age9.87a12.28ab14.23b1.46

3 讨论

3.1 25-OH-D3与维生素D3共晶对肉鸭生长性能、屠宰性能及肉品质的影响

25-OH-D3是目前唯一获得一般公认安全级(GRAS)的维生素D3代谢物。研究认为，25-OH-D3不受肠道胆酸分泌和脂肪含量的影响，比维生素D3更易吸收[1]。维生素D的吸收与脂类相似，通过胆酸形成微团的形式吸收，而25-OH-D3则是直接吸收到门静脉中，无须生成微团，也无须胆酸的存在，因此，25-OH-D3的吸收受肠道损伤的影响较小；25-OH-D3添加到实际饲粮中时，会产生单独使用维生素D或简单地提高饲粮维生素D水平所不能获得的效果[10]。本试验结果显示，与25-OH-D3与维生素D3物理混合相比，饲粮中添加25-OH-D3与维生素D3共晶提高了肉鸭的ADG和ADFI，且添加135.0 μg/kg 25-OH-D3与维生素D3共晶的效果更好。维生素组成、生产工艺和添加形式的不同对其效价和利用率具有较大的影响。研究发现，相对于传统维生素D，一种通过新型的光化学合成25-OH-D3的方法所得到的25-OH-D3晶体提高了原料利用率，有更好的生物效应，同时也节约了成本[11]。吴东峰[12]研究发现，相对于固体维生素，采用液体维生素后喷涂技术可提高异育银鲫的生长性能和抗氧化能力。以上研究结果表明，维生素的形态可以影响其功能的发挥，25-OH-D3和维生素D3共晶可能比其物理混合具有更高的生物学效价，但需要进一步研究证实。

同时，本试验也发现，相对135.0 μg/kg 25-OH-D3与维生素D3共晶组，降低1/2的添加量(67.5 μg/kg)时肉鸭生长性能降低，表明维生素的添加量是影响其效果的重要因素。Edwards[13]研究发现，饲粮中添加27.5 μg/kg维生素D3和5.0 μg/kg 25-OH-D3对于肉鸡ADG和F/G无显著影响。Yarger等[14]试验表明，饲粮中添加70 μg/kg 25-OH-D3可以显著提高49日龄肉鸡体重和胸肌率；但添加量到达105 μg/kg时，则会降低胸肌率[15]。也有研究表明，肉鸡采食高剂量(100 μg/kg)25-OH-D3会出现肾组织钙化[16]。

本试验中，饲粮中添加25-OH-D3与维生素D3共晶对肉鸭的屠宰性能及胸肌率、腿肌率无显著影响，但添加135.0 μg/kg 25-OH-D3与维生素D3共晶可改善肉色，增加肌肉嫩度。近年来，有研究表明，25-OH-D3会影响肉鸡骨骼肌生长、肌纤维组成和大小[17]。由此推断，25-OH-D3可能会影响肉色和肉品质。本试验中，肉色L*、a*和b*值与Bozkurt等[18]研究结果一致，表明这些值在正常范围内[17]。

3.2 25-OH-D3与维生素D3共晶对肉鸭免疫功能的影响

研究表明，维生素D受体可活化T细胞，激活巨噬细胞合成1,25-二羟维生素D3[1,25-(OH)2-D3]，对免疫细胞的分化和增殖具有重要调节作用[18]。25-OH-D3在肾脏中转化为1,25-(OH)2-D3。1,25-(OH)2-D3对单核/巨噬细胞有重要调节作用，可诱导单核细胞抵抗微生物的侵袭，保护细胞的正常功能并加快热应激后正常组织蛋白质的合成，这对巨噬细胞在环境高温下的存活及功能发挥具有重要意义[19]。李德发等[20]试验表明，饲粮中添加适量维生素D3可提高动物机体免疫反应，增加抗体浓度。Chou等[21]研究表明，肉鸡在感染沙门氏菌时，饲粮中添加25-OH-D3会改善其保护性体液免疫。本试验结果发现，饲粮中添加25-OH-D3与维生素D3共晶对肉鸭的免疫功能能有一定影响，且具有剂量效应。从免疫器官指数和14日龄血常规指标可看出，67.5 μg/kg 25-OH-D3与维生素D3共晶组肉鸭体内免疫反应比135.0 μg/kg 25-OH-D3与维生素D3共晶组更强烈。这种现象一方面说明机体免疫活化后需要消化营养物质，导致用于生长的营养物质减少，生长性能降低，这与生长性能指标一致；另一方面也说明免疫活化后是增强了抗病能力还是增加了机体对外界环境应激的敏感性，有待进一步研究证实。

3.3 25-OH-D3与维生素D3共晶对肉鸭骨代谢及胫骨发育的影响

钙对家禽骨骼强度及其发育具有重要的生物学作用，饲粮中钙水平下降会导致肉鸡胫骨粗灰分含量的下降[21]，充足的钙含量会提高骨骼矿物质沉积[22]。维生素D3及其代谢物可提高肉鸡的钙、磷利用率[23]。本试验结果表明，与25-OH-D3与维生素D3物理混合相比，饲粮添加135.0 μg/kg 25-OH-D3与维生素D3共晶显著提高了35日龄肉鸭血清钙含量；同是共晶的情况下，饲粮添加67.5 μg/kg 25-OH-D3与维生素D3共晶显著降低了肉鸭14、35日龄血清钙含量和14日龄血清降钙素含量。有研究表明，只有一种矿物元素长期缺乏，超出动物的调节能力时，血液中矿物元素含量会降低，而血液中的钙主要存在于血清之中[24]。这表明饲粮添加135.0 μg/kg 25-OH-D3与维生素D3共晶能更好地促进胫骨发育及矿化。成骨细胞是骨形成的主要功能细胞，通过分泌骨基质矿化而形成新骨，破骨与成骨过程的平衡是维持正常骨量的关键[25]。有研究发现，饲粮中添加25-OH-D3会提高肉鸡血清钙含量，表明维生素D代谢物会对肉鸡饲粮中钙的利用有促进作用[18]。饲粮中维生素D3水平的变化会直接反映在肉鸡胫骨粗灰分含量上[26]。本试验结果显示，与25-OH-D3与维生素D3共晶物理混合相比，饲粮添加25-OH-D3与维生素D3共晶显著增加了肉鸭35日龄胫骨灰分含量；同是共晶的情况下，饲粮添加67.5 μg/kg 25-OH-D3与维生素D3共晶显著降低了肉鸭14日龄胫骨粗灰分和磷含量以及35日龄胫骨钙含量。张金龙等[27]研究表明，基础饲粮中添加12.5和25.0 μg/kg 25-OH-D3会显著提高肉鸡胫骨重量及粗灰分、钙、磷含量。Zhang等[28]也研究发现，饲粮中添加69 μg/kg 25-OH-D3可增加肉仔鸡胫骨钙含量。