乙酰化修饰在影响细菌对核糖体靶向抗生素敏感性中的作用

来亚男，姚玉峰，郭晓奎，倪进婧

1.上海交通大学基础医学院免疫学与微生物学系，上海200025；2.上海交通大学医学院-国家热带病研究中心全球健康学院，上海200025

核糖体是蛋白质的合成机器，部分临床上常用的抗生素通过阻断细菌核糖体的蛋白质合成来发挥抗菌作用［1］。细菌核糖体由30S小亚基和50S大亚基组成，包含3 种核糖体RNA（ribosomal RNA，rRNA）和54 种核糖体蛋白［2］。很多已知的抗生素作用于核糖体翻译的延伸阶段，如氨基糖苷类、大环内酯类、氯霉素类、夫西地酸类和四环素类等［3］。细菌为了避免其被药物清除，可通过一系列限制性行为减少药物对自身的作用。例如，某些革兰阴性菌通过外膜来阻止抗生素进入细胞［4］。除此之外，细菌还可对核糖体成分修饰或使其发生突变，来减弱抗生素与核糖体的结合能力。例如细菌通常会利用甲基转移酶来甲基化修饰50S 亚基23S rRNA 或30S 亚基16S rRNA，获得耐药性［5-6］；30S 亚基核糖体蛋白S12的突变也被证明可诱导细菌对引起蛋白质错误合成的抗生素如链霉素产生耐药性［7-8］。

乙酰化修饰是细菌体内主要的蛋白翻译后修饰类型，对蛋白质表达和细胞代谢具有多个方面的影响。例如，乙酰化修饰影响细菌的致病性［9］、对外界环境的应答［10］和代谢过程等［11］。在细菌中，蛋白质乙酰转移酶（protein acetyltransferase，Pat）是目前研究较充分的乙酰转移酶［12］。乙酰磷酸（acetyl-phosphate，AcP）可直接将其自身的乙酰基团转移到赖氨酸残基ε-氨基上；相比Pat，AcP 的底物范围更广，但特异性较低［13-14］。AcP 的水平取决于磷酸转乙酰酶（phosphotransacetylase，Pta）催化生成乙酰辅酶A 的速率，以及被乙酸激酶（acetate kinase，AckA）降解为乙酸的速率。敲除编码AckA 的基因ackA 会导致细胞内AcP 含量升高。乙酰化修饰也能被烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖性去乙酰化酶（NAD+-dependent protein deacylase，CobB）进行去乙酰化修饰，它可以去除Pat 和AcP 2 种修饰途径来源的乙酰基团［15］。细菌核糖体是临床常用抗生素的主要靶标。研究［7-8］证实核糖体蛋白的突变会影响细菌对抗生素的敏感性。课题组前期通过乙酰化质谱分析，发现鼠伤寒沙门菌（Salmonella enterica serovar Typhimurium，S. Typhimurium）的核糖体蛋白存在广泛的乙酰化修饰，然而这种普遍的修饰状态是否影响抗生素与细菌的结合还未知。故本研究以3 种乙酰化修饰相关基因敲除株（pat 基因敲除株Δpat、cobB基因敲除株ΔcobB和ackA基因敲除株ΔackA）为研究对象，探究细菌乙酰化修饰对抗生素与细菌结合关系有无影响，从而为寻找解决细菌耐药问题提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌株 S.Typhimurium 14028S 菌株购自美国典型培养物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）。 Δpat、 ΔcobB、 ΔackA 是 在S. Typhimurium 14028S 的遗传背景下分别敲除pat 基因、cobB 基因、ackA基因获得的菌株，均来自本实验室。

1.1.2 试剂与仪器 嘌呤霉素（货号A610593）、四环素（货号A100422）、壮观霉素（货号A600901）、巴龙霉素（货号A614181）均购于生工生物工程（上海）股份有限公司。Easyspiral dilute细菌涂布仪购于上海书俊仪器设备有限公司，Synergy 2酶标仪购于美国伯腾仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细菌生长曲线测定 挑取单克隆菌落于无菌LB培养基（Luria-Bertani medium）中，37 ℃过夜培养；用新鲜LB 培养基调整菌液在波长600 nm 处的吸光度值D（600 nm），待D（600 nm）=1 后，将菌液按照1∶10 的比例转接，使起始D（600 nm）=0.1，之后每1 h 测量1 次D（600 nm）。以时间为横坐标，D（600 nm）为纵坐标，绘制细菌生长曲线。

1.2.2 抗生素梯度稀释液制备 根据Wiegand等［16］的方法制备抗生素梯度稀释液。首先配置成浓度为1 280 mg/L的抗生素母液。计算公式为W=（C×V）/P，其中W=需溶解的抗生素质量（mg），V=实验需要的体积（mL），C=最终储存浓度（μg/mL），P=说明书中显示的抗生素有效含量（μg/mg）。按照表1 在无菌试管中用无菌LB 培养基制备抗生素稀释液。

1.2.3 菌落形成单位计算 挑取单克隆菌落于新鲜的LB培养基中，37 ℃过夜培养，测定过夜培养菌液的D（600 nm）。用无菌磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）按照1∶10的比例倍比稀释菌液直至稀释度达到10−7；分别取100 μL 10−4～10−7稀释度的菌液涂布平板，37 ℃培养，隔日计数每个平板中的单克隆菌落数。菌落形成单位（colony forming unit，CFU）根据公式N=C×101+D计算，其中N=每毫升菌液的CFU数，C=每个平板中的单克隆菌落数（100～400 个），D=按照1∶10 进行稀释的次数。实验重复3 次，取平均值。确定D（600 nm）与CFU的关系系数。

表1 抗生素稀释液的配制Tab 1 Preparation of antibiotic dilution

1.2.4 肉汤稀释法测定最低抑菌浓度 根据D（600 nm）和CFU 的关系系数，调整过夜培养菌液的起始接种量为1×108CFU/mL。取96 孔板，无菌对照孔加入100 μL 无菌LB培养基，生长对照孔加入50 μL无菌LB培养基，其他孔加入各稀释度抗生素50 μL。将1×108CFU/mL细菌悬浮液按照1︰100稀释，在生长对照孔和加入各稀释度抗生素的孔中加入50 μL细菌悬液，充分混匀。37 ℃孵育16～20 h，酶标仪测量D（600 nm），同时可通过涂布法确保96孔板中细菌数量约为5×105CFU/mL。当某稀释度抗生素对应的孔中与无菌对照孔中菌液的D（600 nm）相同，则该稀释度下的抗生素浓度即为最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）。

1.2.5 稀释点板实验 将过夜培养菌液按照1∶100 转接至新鲜的LB 培养基中，培养至D（600 nm）=1。取1 mL菌液3 000×g离心8 min，无菌PBS洗涤，调整D（600 nm）至0.1。按照1∶10的比例倍比稀释至10−4稀释度。取各稀释度（100、10−1、10−2、10−3、10−4）菌液2 μL 依次点板，37 ℃培养16 h，观察细菌的生长状态。

2 结果

2.1 乙酰化修饰对细菌生长状态的影响

为了排除乙酰化修饰对细菌生长状态的影响，首先测量了S.Typhimurium 14028S及3种乙酰化修饰相关基因敲除株Δpat、ΔcobB和ΔackA的生长曲线。由于点板稀释实验设置的初始D（600 nm）=0.1，故以D（600 nm）=0.1作为起始D（600 nm）连续监测。图1 显示，随着培养时间的增加，S.Typhimurium 14028S 和3 种乙酰化修饰相关基因敲除株的生长曲线较为吻合，表明乙酰化和去乙酰化修饰不影响细菌的生长状态。此外，在D（600 nm）都为0.1 的情况下，通过稀释涂布法确定的3 种乙酰化修饰相关基因敲除株和S.Typhimurium 14028S 活菌数量也没有明显差异。

2.2 S.Typhimurium 14028S的MIC测定

为了探究乙酰化修饰是否影响细菌对核糖体靶向抗生素的敏感性，我们选择4种核糖体靶向抗生素——嘌呤霉素、巴龙霉素、四环素和壮观霉素，通过肉汤稀释法检测其对S. Typhimurium 14028S 的MIC。结果显示：嘌呤霉素的MIC 为256 mg/L，巴龙霉素的MIC 为32 mg/L，四环素的MIC为4 mg/L，壮观霉素的MIC为128 mg/L。

图1 S.Typhimurium 14028S和各乙酰化修饰相关基因敲除株的生长曲线Fig 1 Growth curves of S. Typhimurium 14028S and acetylation related gene mutants

2.3 乙酰化修饰相关基因敲除株对核糖体靶向抗生素的敏感性

根据上述MIC 测定结果，制备浓度低于相关抗生素MIC 的含抗生素平板培养基。培养S. Typhimurium 14028S 和3 种乙酰化修饰相关基因敲除株单克隆，调整D（600 nm）=0.1；将菌液按照1∶10 的比例倍比稀释至10−4稀释度，取10−4～100稀释度的菌液分别点板。

2.3.1 乙酰化修饰相关基因敲除株对嘌呤霉素的敏感性 在无抗生素的平板培养基上，4种菌株的生长状态相似且生长状态均正常（图2）。在含128 mg/L 嘌呤霉素的平板培养基上，S. Typhimurium 14028S、Δpat 和ΔcobB的生长状态正常，ΔackA（胞内AcP 含量增加，乙酰化程度升高）显示生长缺陷，表明在AcP 的调控下，细菌对结合在50S 亚基上的嘌呤霉素的敏感性提高。cobB 基因敲除后（ΔcobB），虽然整体乙酰化程度升高，但ΔcobB 在点板稀释实验中并没有明显表型，表明去乙酰化酶CobB 不参于调控S. Typhimurium 对嘌呤霉素的敏感性。

2.3.2 乙酰化修饰相关基因敲除株对巴龙霉素的敏感性 在含8 mg/L 巴龙霉素的平板培养基上，S.Typhimurium 14028S、ΔcobB 和ΔackA 的生长状态较为正常，但Δpat已经出现明显的生长缺陷；在含16 mg/L巴龙霉素的平板培养基上，10−4～100稀释度的ΔackA仍然可以生 长，而10−3和10−4稀 释 度 的S. Typhimurium 14028S 和ΔcobB的生长受到明显抑制（图3）。这一结果表明乙酰化程度降低（Δpat），S.Typhimurium对巴龙霉素的敏感性增加；而乙酰化程度升高（ΔackA），S.Typhimurium 对巴龙霉素的敏感性降低。巴龙霉素可引起细菌翻译错误率升高。相比S. Typhimurium 14028S，Δpat 呈现明显的生长缺陷表型，表明乙酰化修饰对于细菌维持正常的翻译保真度至关重要。

图2 嘌呤霉素的点板稀释实验结果Fig 2 Spot dilution assay of puromycin

图3 巴龙霉素的点板稀释实验结果Fig 3 Spot dilution assay of paromomycin

2.3.3 乙酰化修饰相关基因敲除株对四环素和壮观霉素的敏感性 3种乙酰化修饰相关基因敲除株在同一四环素和壮观霉素浓度下，生长状态和生长受到抑制的程度与S.Typhimurium 14028S 相同（图4、5），表明乙酰化程度增高（ΔcobB、ΔackA）或降低（Δpat），S.Typhimurium对四环素和壮观霉素的敏感性没有受到影响。

图4 四环素点板稀释实验Fig 4 Spot dilution assay of tetracycline

图5 壮观霉素点板稀释实验结果Fig 5 Spot dilution assay of spectinomycin

3 讨论

蛋白质是所有生物体生存的物质基础。真核生物和原核生物的蛋白质翻译过程存在明显差异，一些抗生素的开发正是利用了这一差异［17］。本实验室前期的乙酰化质谱分析显示S.Typhimurium 的核糖体蛋白存在广泛的乙酰化修饰，并且受AcP 和Pat共同调控。核糖体蛋白的氨基酸突变会影响细菌对抗生素的敏感性［18］，但核糖体蛋白翻译后修饰在其中的作用尚不清楚。本研究以3种乙酰化修饰相关基因敲除株为研究对象，并选择4种核糖体靶向抗生素，来探究细菌核糖体蛋白的乙酰化修饰在应对抗生素的作用时所扮演的角色。

嘌呤霉素因为其分子结构类似于氨酰转运RNA（aminoacyl transfer RNA，aa-tRNA）而被掺入肽链的合成，从而导致肽链合成提前终止，其作用位点位于肽酰转移酶活性中心［19］。我们发现ackA 基因敲除后，即乙酰化程度升高，S.Typhimurium 对嘌呤霉素的敏感性增加。通常嘌呤霉素掺入导致细菌蛋白质翻译终止的原因是肽酰转移酶对其的识别和催化，但在乙酰化程度升高的情况下，S.Typhimurium 对嘌呤霉素的敏感性增加，我们猜测乙酰化修饰可能会增加肽酰转移酶的活性从而导致更多嘌呤霉素的掺入。

巴龙霉素结合在细菌核糖体30S亚基的解码中心，引起其构象变化，从而影响A 位点上mRNA 和aa-tRNA 密码子反密码子螺旋的形成［20］。我们发现ΔackA 菌株对巴龙霉素的敏感性降低，这一结果提示乙酰化修饰可能会影响30S亚基解码中心结构域的构象，从而影响巴龙霉素的结合。细菌核糖体蛋白的氨基酸突变，造成核糖体蛋白侧链结构改变，影响抗生素结合位点的空间构型，从而影响细菌对抗生素的敏感性［18］。我们猜测乙酰化修饰降低S.Typhimurium 对巴龙霉素的敏感性，可能是核糖体蛋白的乙酰化修饰所致。核糖体蛋白的赖氨酸发生乙酰化修饰，会中和生理条件下核糖体蛋白赖氨酸所带的正电荷；同时乙酰基团的掺入会使蛋白质侧链结构发生变化；这2 种改变都可能会削弱核糖体蛋白与rRNA 的结合，影响核糖体结构，从而导致巴龙霉素在核糖体上结合位点的空间构型发生改变。但乙酰化修饰影响S.Typhimurium 对巴龙霉素敏感性的具体调节机制仍需要进一步研究。

四环素阻止aa-tRNA 结合到30S 亚基A 位点［21］，使其被16S rRNA 完全包围，与核糖体蛋白没有任何接触。壮观霉素抑制tRNA-mRNA 的易位过程，除了与16S rRNA 的螺旋34（helix 34）相互作用外，与核糖体蛋白S5的第25位赖氨酸也存在相互作用［21］。我们发现乙酰化修饰程度改变不影响S.Typhimurium 对这2 种抗生素的敏感性，表明乙酰化修饰不影响抗生素结合位点的空间构型。但不能认为核糖体蛋白的乙酰化修饰在其中没有发挥作用，因为乙酰化修饰是对核糖体蛋白整体的功能调控，并非对某一核糖体蛋白的单一调控。一个比较经典的例子是核糖体蛋白S12和S4之间的关系。有研究［22］发现S12 突变后会减弱S.Typhimurium 的毒力，但在S12 突变株中会出现高频率的S4 突变株来回补毒力。同理，乙酰化修饰也是一种全局性调控，影响核糖体蛋白与rRNA、tRNA 等组分之间的相互作用，从而保证细菌在应对各种胁迫环境下依然能够生存。

本研究发现乙酰化修饰会影响细菌对核糖体靶向抗生素的敏感性，这种影响可能是通过核糖体蛋白的乙酰化修饰来调控的。探究乙酰化修饰与细菌对抗生素敏感性的关系对于解决临床上日益严重的耐药问题以及新药的研制具有重要的意义。