生物信息学分析miR-221/26a、lncRNA GAS5和RECK mRNA在结直肠癌转移中的作用*

孟涛，刘林，王海江

(新疆医科大学附属肿瘤医院 胃肠外科，新疆 乌鲁木齐 830011)

结直肠癌(colorectal cancer)是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率均位居恶性肿瘤的前列[1]。约有40%结直肠癌患者最终死于复发和转移[1-5]，且其发生机制仍不明确。因此，研究结直肠癌转移的发生机制具有重要的意义。回复引导半胱氨酸丰富蛋白Kazal基元(reversion inducing cysteine rich protein with kazal motifs，RECK)是一个公认的肿瘤转移抑制因子，研究显示RECK与结直肠癌转移有密切的关系[2]。MicroRNA(miRNA)是一类长度在19～24个核苷酸的内源性非编码小分子单链 RNA，能通过与靶基因 miRNA 特异性的碱基互补配对,引起靶基因 miRNA 的降解或者抑制其翻译，负调控靶基因的表达，参与和影响细胞分化、组织发育、肿瘤诊断及预后[3]；而长编码 RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一类长度超过 200个核苷酸、不编码蛋白的RNA，在发育、分化及代谢等多方面发挥着重要作用[4]。miRNA和lncRNA都高度保守稳定，可竞争性结合并调控靶基因参与肿瘤的发生发展，因而可作为潜在标志物用于肿瘤的预测、诊断及预后的判断[5-8]。本研究通过生物信息学方法找出结直肠癌转移相关的miRNA及lncRNA，并选取结直肠癌变组织及其对应的癌旁观察其表达，分析它们的相互作用及对结直肠癌转移的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂及仪器

Trizol 购自上海生工公司，miRcute miRNA cDNA 试剂盒(KR201)、miRcute增强型miRNA荧光定量检测试剂盒(SYBR Green，FP411)及lnRcute lncRNA荧光定量检测试剂盒(SYBR Green) (FP402) 购自北京天根生化科技有限公司，lncGAS5过表达质粒及含lncGAS5启动子的CRISPR-Cas9质粒购自吉凯基因公司，转染试剂Lipofectamine 3000购自Thermo Fisher,DMEM等细胞培养试剂购自Gibco公司；Anti-RECK抗体(ab238162)和山羊抗兔IgG H&L (HRP，ab205718)购自Abcam，所用引物U6、RECK及 miRNA 26a购自广州复能公司。

1.2 方法

1.2.1生物信息学预测 利用miRanda数据库(http://www.microrna.org/microrna/home.do)和 Starbase数据库(http://starbase.sysu.edu.cn/)预测RECKmRNA-miRNA,miRNA-lncRNA的结合位点并做分析。

1.2.2构建过表达和沉默lncGAS5的SW480细胞 在转染的前一天，传代准备SW480细胞，待细胞密度生长至60%～80%时即可用于质粒转染。将2种质粒分别与转染试剂Lipofectamine 3000(先用不含血清及双抗的DMEM培养基稀释)混匀，加入到SW480细胞中；于37 ℃培养箱培养6～8 h后，取出转染细胞，用2 mL新鲜的不含双抗的完全培养基换掉原培养基，转染48 h后、加入嘌呤霉素(3.0 mg/L)进行筛选。10～15 d后收取细胞提取RNA和蛋白。

1.2.3RNA、miRNA、lncRNA提取 取手术切除的结直肠癌患者结直肠癌变组织及癌旁 5 cm 以上的正常黏膜组织，用Trizol提取总RNA，用试剂盒提取miRNA和lncRNA，紫外分光光度仪测定浓度及纯度(OD260/OD280>1.8可用)。按照试剂盒说明书对miRNA和lncRNA进行荧光定量检测。

1.2.4荧光定量PCR(qPCR) 吸取1.2.3中得到的RNA，加入超纯水，70 ℃孵育5 min，冷却后置于冰上，加入反转录酶，42 ℃孵育60 min，70 ℃加热10 min，保存于-20 ℃。基因引物由上海生工生物有限公司合成：lncRNA GAS5，F为5-CTTCTGGGCTCAAGTGATCCT-3，R为5-TTGTGCCATGAG

ACTCCATCAG-3；GAPDH，F为5-ACCAGCCCCAGCAAGAGCACAAG-3，R为5-TTTGCTTGAAGTTTCA

CTGGCATC-3；miR-221，F为5-AGCTAAAAAAGCTACATTGTCTGCTGGGTTTCG-3，R为5-GATCCGA

AACCC AGCAGACAATGTAGCTTTTTT-3)。反应条件为95 ℃ 2 min，95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 5 min，32个循环。实验重复3次，采用2-ΔΔCt法计算基因的相对表达量。

1.2.5ECK蛋白表达水平 采用蛋白质印迹法(Western blot)，将少量组织或构建过表达和沉默lncGAS5的SW480细胞置于匀浆器中，加入蛋白质裂解液研磨至无肉眼可见组织置于冰上裂解30 min，将裂解液转移至离心管中，4 ℃ 12 000 r/min离心5 min，取上清，在紫外分光光度仪上测定蛋白质浓度并置-20度保存。制胶后，加入50 ng变性蛋白溶液进行电泳及蛋白转移，结束后加入RECK一抗和二抗进行孵育，最后进行凝胶图像分析。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 预测RECK/miRNA/lncRNA结合位点及组织标本中含量测定

利用miRanda数据库预测结果显示(表1)，RECKmRNA与miR-221有4个结合位点，与miR-26a有1个结合位点，推测miR-221/26a能靶向结合到RECKmRNA上对其进行调控。利用Starbase数据库预测结果显示lncRNA GAS5与miR-221/26a存在1个结合位点，提示它们之间存在相互作用关系。因此，利用qPCR对结直肠癌组织和癌旁组织中lncRNA及miR-221/26a的含量进行验证(图1)，结果显示在结直肠癌组织中，miR-221/26a的表达高于其相应的癌旁组织 (P<0.001、或0.05)，lncRNA GAS5 在结直肠癌中表达水平降低，差异具有统计学意义(P<0.001)。

表1 miRanda数据库预测RECK mRNA与miR-221/26a结合位点Tab.1 Predicted binding sites of RECK mRNA with miR-221/26a using miRanda database

表2 Starbase数据库预测lncRNA GAS5与miR-221/26a结合位点Tab.2 Predicted binding sites of lncRNA GAS5 with miR-221/26a using Starbase database

图1 lncRNA GAS5及miR-221/26a在结直肠癌组织及癌旁组织中的表达Fig.1 The relative expression levels of lncRNA,miR-221,and miR-26a in CRC tissues and corresponding adjacent tissues

2.2 过表达lncRNA GAS5的SW480细胞中lncRNA GAS5及miR-221/26a表达

取稳转lncRNA GAS5后的SW480细胞提取RNA和蛋白，结果如图2所示。结果显示，过表达组SW480细胞中GAS5相对含量为0.137±0.045，转染空载组含量为 0.031±0.015，过表达组GAS5的含量是空载组的4.4倍，2组比较差异有统计学意义(P<0.05)。过表达组SW480细胞中的miR221相对含量为0.004±0.001，空载组为0.010±0.002，过表达组低于空载组，仅为空载组的0.4倍，差异有统计学意义(P<0.01)。过表达组SW480细胞中的miR26a相对含量为0.005 8±0.002 3，空载组为0.012±0.001，过表达组低于空载组，仅为空载组的0.48倍，差异有统计学意义(P<0.01)。Western blot结果显示，过表达组细胞中的RECK蛋白表达含量低于空载组。

注:与空载组比较，(1)P<0.01，(2)P<0.01。图2 稳转lncRNA GAS5后SW480细胞中lncRNA GAS5及miR-221/26a表达Fig.2 The expression levels of lncRNA,miR-221,and miR-26a in SW480 cells overexpressing lncRNA GAS5

2.3 lncGAS5 沉默细胞株情况

将质粒转染到SW480细胞后，用qPCR检测lncGAS5、miR221及miR26a含量，结果如图3所示。结果显示，GAS5在沉默组SW480细胞中相对含量约为0.000 5±0.000 13，而在空载组则为0.032±0.005 6，沉默组低于空载组，差异有统计学意义(P<0.01)，提示成功建立lncGAS5 沉默细胞株。miR221在沉默组相对表达含量为0.078±0.021，空载组中为0.03±0.02，沉默组高于空载组，差异有统计学意义(P<0.01)。miR26a在沉默组相对表达含量为0.059±0.007 3，空载组中为0.039±0.011，沉默组高于空载组，差异有统计学意义(P<0.01)。提示GAS5的降低在一定程度上会上调miR221和miR26a的含量。Western blot 结果显示，沉默GAS5时，RECK蛋白表达增加。

3 讨论

我国结直肠癌的发病率和死亡率均呈上升趋势，其发病率、死亡率在所有恶性肿瘤中均居第5位[6]。因此，寻找和发现结直肠癌相关的癌基因并揭示和预测其在结直肠癌的病程进展和转移过程中的功能，对于结直肠癌的诊治具有十分重要的理论意义和实际应用价值。

RECK是一个公认的肿瘤转移抑制因子，其蛋白主要定位于细胞外。它富含半胱氨酸，是一类膜锚定糖蛋白，在常见细胞中通过转录后能调控多种基质金属蛋白酶(MMPs)的表达，阻遏肿瘤血管生成，从而抑制肿瘤的侵袭与转移[7]。有研究发现，在结直肠癌病人的肿瘤样本中，RECK的表达水平和病人复发风险有关，高浓度的RECK往往预示着病人的复发风险较低。此外通过动物及细胞实验发现，提升RECK的表达能抑制肿瘤细胞的侵袭、转移及血管新生[8-9]。以上研究提示RECK与结直肠癌转移有密切的关系。课题组在前期研究中探讨了RECK蛋白和mRNA在原发肿瘤组、结直肠转移灶组以及癌旁组织的表达情况，证实了RECK蛋白及mRNA水平在肿瘤组中是呈低表达的，且在转移灶组中RECK蛋白及mRNA表达量更低。

注:(1)与空载组比较，P<0.01。图3 沉默lncRNA GAS5的SW480细胞的qPCR及Western blot 结果Fig.3 The results of qPCR and Western blot in SW480 cells silencing lncRNA GAS5

miRNA是一类约含22个核苷酸的非编码小分子单链RNA，通过与靶基因mRNA的3’端非翻译区上的相应靶点结合，能抑制或降解特定靶基因，从而起到调节蛋白质合成的作用[10-11]。有研究发现miR-25-3p通过调节内皮细胞相关因子表达，可以促进血管通透性和血管生成，同时大肠癌细胞的miR-25-3p外显子可显著诱导大肠癌的血管渗漏，促进大肠癌在肝、肺的转移。此外，miR-25-3p的表达水平在发生转移的大肠癌患者中明显高于无转移者，证明了miR-25-3p是一种促进结直肠癌转移的miRNA[12]。有学者发现与直肠癌相关的miRNA约有50多个，这些miRNA可通过改变Wnt通路的β-连环蛋白(βcatenin)、表皮生长因子受体(EGFR)、转化生长因子-β(TGF-β)和肿瘤抑制蛋白(TP53)等信号通路来影响大肠癌的生存、增殖、侵袭和转移，因此，miRNA与结直肠癌的发生发展密不可分[14-15]，而lncRNA与miRNA一样，属于非编码RNA，区别是lncRNA转录本长度超过200个核苷酸，在生物发育、分化和代谢等方面起到了重要调控作用，成为近年来的研究热点[16-18]。不少研究显示lncRNA和miRNA存在竞争结合参与肿瘤细胞的侵袭和转移[19-21]。如Wang等[22]人在综述中就提到40多种lncRNA/miRNA参与结直肠癌发生发展的情况。

本研究利用生物信息学进行预测，发现了多条与RECKmRNA相结合的miRNA，其中 miR-221 与之有4个结合位点，miR-26a 与之有1个结合位点，由此推测RECK表达与这2个miRNA有关系，进而对结直肠癌病人的肿瘤组织和癌旁组织中miR-221/26a进行验证。结果显示这2个miRNA在结直肠癌肿瘤组织中高表达。这或许暗示了在结直肠癌中，上调的miR-221/miR-26a 通过结合RECKmRNA，抑制了RECK蛋白的表达，从而促进结直肠癌的转移。同时数据库分析结果还显示lncRNA GAS5能同时结合 miR-221、miR-26a，本研究也对结直肠癌病人的肿瘤组织和癌旁组织中lncRNA GAS5进行验证，结果显示lncRNA GAS5在结直肠癌肿瘤组织中呈低表达。

以上结果初步提示在结直肠癌细胞中，lncRNA GAS5表达降低，会使得 miR-221 和miR-26a 的丰度升高，从而抑制了RECKmRNA 表达，最终促进结直肠癌细胞转移。基于以上推测，本研究在SW480细胞中过表达了lncRNA GAS5，通过测定GAS5含量提示我们过表达细胞模型构建成功且miR-221/26a含量随着GAS5的增加而下降，RECK蛋白含量降低，提示GAS5能通过负反馈miR-221/26a含量影响RECK蛋白表达。同时，本研究还通过转染含GAS5启动子的CRISPR-Cas9质粒，下调其含量，并检测miR-221/26a变化，结果发现随着GAS5含量下降，miR-221/26a和RECK表达均上调。通过细胞实验可以初步证实lncRNA GAS5表达降低，对 miR-221 和 miR-26a 的吸附作用降低，导致 miR-221 和miR-26a 的表达升高，结果提示miR-221 和 miR-26a 能与抑癌基因RECKmRNA结合，并抑制其表达，进而最终促进结直肠癌细胞转移。

综上所述，本研究先通过生物信息学预测出相关的lncRNA和miRNA，再通过构建过表达和沉默细胞株验证GAS5，miR-221/ 26a和RECK之间的关系，结果表明lncRNA GAS5和miR-221 /miR-26a与结直肠癌发展密切相关，检测其含量变化可提前为癌细胞是否转移做出预测。