LRIT3基因突变与先天性静止性夜盲

王运昌，李荣荣，蔡祎，邵长亮，赵慧然，魏子依，王莉菲

（河北省眼科医院，河北省眼科学重点实验室，河北省眼病治疗中心，邢台 054001）

先天性静止性夜盲(congenital stationary night blindness, CSNB)是在临床表现及遗传方式均出现异质性的一组视网膜异常，由光感受器启动的信号级联反应及其与双极细胞信号传导有关蛋白基因突变所致［1］。迄今为止，与CSNB相关的突变基因超过了300个［2］，比如夜盲蛋白（nyctalopin, NXY）基因NYX、代谢性谷氨酸受体6 （metabotropic glutamate receptor 6, mGluR6/ GRM6）基因GRM6，瞬时受体电位美拉他汀1 （transient receptor potential melastatin 1, TRPM1）基因TRPM1和G蛋白受体179（G protein receptor 179, GPR179）基因GPR179突变，导致对应蛋白无法定位于ON-双极细胞（ON-BCs）树突，表现为cCSNB；钙离子通道α1F亚基（calcium channelα 1F subunit CACNA1F）基因CACNA1F、钙离子结合蛋白4（Ca2+-binding protein 4, CABP4）基因CABP4和钙离子通道α2δ4亚基（calcium channel subunit α2δ4, CACNA2D4）基因CACNA2D4突变，导致光感受器与双极细胞突触间隙谷氨酸盐不能持续释放，表现icCSNB。在视网膜的外丛状层，光感受器细胞与双极细胞形成突触，在突触后表面由亮氨酸富集重复序列免疫球蛋白样结构域和跨膜结构域蛋白3 （leucine-rich repeat，immunoglobulin-like and transmembrane domains protein 3, LRIT3）、NXY、mGluR6、GPR179和TRPM1组成信号通路复合体，对ON-双极细胞去极化起到关键作用；突变的LRIT3与NYX、GRM6、TRPM1和GPR179均可使突触后信号复合体功能障碍，表现为b波严重下降或缺失。LRIT3突变病人ON-双极细胞功能异常而OFF-双极细胞功能未受影响，提示LRIT3在锥细胞与ON-双极细胞突触的形成及其功能上有选择性作用。近年来国内外学者对于LRIT3突变方式及其突变后表达的障碍，LRIT3蛋白特异性结构对于信号转导的作用有了比较深入的研究。本文将从人及动物模型LRIT3突变的研究现状、LRIT3蛋白结构及突触后信号复合体研究现状、LRIT3蛋白在锥细胞-ON-BCs突触形成及信号传导的特异性作用这三方面来阐述。

1 人及动物模型LRIT3突变的研究现状

1.1 人LRIT3突变的研究现状

目前关于LRIT3表达、定位及功能的研究很有限，运用基因表达序列标签法可测得LRIT3在中枢神经和视网膜表达，LRIT3位于染色体4q25包括4个外显子1区域［7］。目前为止，国内外对于人LRIT3突变位点的研究依旧很局限。

Zeitz et al率先利用外显子测序法对cCSNB的DNA样本测定，确定了LRIT3两个复合杂合子突变［2］，分别为位于外显子4的c.[1151C>G];[1538_1539del](p.[Ser384*];[Ser-513Cysfs*59])和c.[983G>A]; [1318C>T] (p.[Cys328Tyr]; [Arg440*])。p.[Ser384*]、p. [Arg440*]、p. [Ser513Cysfs*59]产生的蛋白均缺少跨膜结构域和PDZ-结合模序（PSD95, DLG1andZO1-binding motifs），无法与LRIT3蛋白一同形成支架，因而位于细胞质的TRPM1不能被转运至细胞表面［4］，在光刺激下，锥、杆细胞末端释放谷氨酸盐减少，ON-BCs树突的mGluR6处于非结合状态，G蛋白失活，离子通道TRPM1开放，Ca2+进入细胞内，ONBCs去极化产生b波，TRPM1在ON-BCs表面的表达障碍会出现ERG b波缺失，临床上会出现稳定无进展的夜盲症状；p.[Cys328Tyr]替换亦可由NYX突变产生，会导致内质网中没有装配的蛋白聚集进而影响二硫键形成，表现为视蛋白合成障碍出现色觉异常[5]，LRIT3突变不仅会使ON-BCs信号通路异常，还会导致高度近视产生［6］。

LRIT3对成纤维细胞生长因子受体1（fibroblast growth factor receptor, FGFR1）有调控作用［7］，突变的LRIT3会使内质网产出有缺陷的FGFR1从而不能够准确的使FGFR1信号通路分支PLC-γ（Phospholipase C-γ）激活；或者突变的LRIT3不能成功将FGFR1装配，从而使PLC-γ持续激活。异常的FGFR1信号通路会导致新生儿颌面部、颅骨发育异常或是癌症[7]。

Handong Dan等通过对我国8个不相关的cCSNB家系源头研究发现了一个新的复合杂合子突变 体［8］，c.[1A>G];[608G>T](p.[0?]; p.[W203L])。c.[1A>G] (p.[0?])改变了LRIT3的起始密码，导致转录无法开始，因此转录只能在下一个ATG开始，基因的阅读框架相应发生改变；c.[608G>T] (p.[W203L])是错义突变，位于LRIT3蛋白leucine-rich repeat C-terminal (LRRCT)结构域201-253氨基酸之间，此结构域属于核苷酸绑定蛋白家族，对自身免疫有调节作用。以上突变均可使LRIT3蛋白合成障碍。

1.2 LRIT3突变动物模型的研究现状

在敲除了LRIT3的等位基因或是因错义突变的动物模型中，我们发现与人类类似的b波的缺如，用免疫印记的方法也未能检测到ON-双极细胞树突[3]上LRIT3的表达，从而验证了LRIT3在动物模型ON-双极细胞介导的信号转导上的重要作用。

LRIT3突变大鼠模型：该模型在暗适应及明适应条件下，ERG的b波均严重下降或缺失，称为no b-wave (nob)，与人LRIT3突变致cCSNB的ERG表现一致；分别在6周、6个月时对其标记，故称为nob6[9]。nob6为携带敲除了LRIT3的等位基因纯合子突变体，外显子3和4被删除、Bgeo/Purocassette插入此区域，前8对碱基包含一个未成熟的终止密码子(c.611_2046delinsGGCCATAG)，使LRIT3蛋白缺少206个氨基酸，其中包含跨膜蛋白结构域和PDZ-结合模序，继而ON-BCs无法去极化，出现与人相关基因突变一致的夜盲的表现［9］。

LRIT3突变犬模型：Rueben等通过对ERG表现为cCSNB的比格犬［11］模型研究，发现在32号染色体上一个4.6Mb位点，运用全基因组相关研究和全基因组测序的方法确定了LRIT31个单一碱基删除的纯合子突变（CFA32: 30,038,862_30,038,863delG）此移码突变造成LRIT3缩短，运用免疫组织化学的方法可检测到其视网膜ON-BCs树突上强度减弱的免疫标志物［12］。

2 LRIT3蛋白结构及突触后信号复合体研究现状

LRIT蛋白超家族包含多种亚型，在结构上的共同特点为跨膜结构域，在细胞膜发生去极化及超极化时，其跨膜结构的特点能够将电信号传导至突触后信号复合体。

2.1 LRIT3蛋白

LRIT3蛋白属于LRR（leucine-rich repeat, LRR）家族蛋白成员。LRR首次由Takahashi 等在1985年通过对人血清leucine-rich α2-glycoprotein测序分离提取［10］，并描述其是一种细胞膜起源、与细胞膜相关的蛋白，包括一系列具有双极性的结构域；其在细胞黏附，胞内物质跨膜转运，调控细胞因子信号转导方面有重要作用，主要表达于中枢和视网膜。

LRIT3蛋白包括1个单肽（1—19氨基酸）和4个LRR结构域（82—104, 106—128, 130—152和154—176），其侧面是cysteine-rich LLRNT（20—61氨基酸）和LRRCT（201—253氨基酸）模序；除此之外还包括免疫球蛋白样结构域（254—344氨基酸），纤维连接蛋白Ⅲ（484—574氨基酸），跨膜蛋白结构域（583—633氨基酸）。C-末端区域高度保守可能隐含一个PDZ结合模序［13］，另外，LRIT3蛋白包含1个serine-rich 区域 (氨基酸373—433)和2个半胱氨酸残基, Cys275和Cys328, 合成二硫键［2］。

2.2 突触后信号复合体

TRPM1在内质网合成并由高尔基体修饰后进入胞浆，Pearring等研究表明TRPM1在ON-BCs树突上的正确定位需要mGluR6/GRM6和NXY的表达［10］；NXY位于细胞外，其与LRIT3细胞内PDZ结合模序相互作用［14］使TRPM1定位于光感受器与ON-BCs树突上并维持一定水平，NXY还在TRPM1的合成，及其在ON-BCs树突上稳定表达发挥作用[15]。

GPR179能够正确定位G蛋白信号蛋白调节因子（regulator of G protein signaling proteins, RGS）从而使G蛋白激活。Ray等推测NXY、mGluR6、GPR179和TRPM1形成突触后信号通路复合体，LRIT3蛋白在复合体相关蛋白（mGluR6、TRPM1、GPR179、NXY、RGS7、RGS11、R9AP、Gα0、Gβ13、Gβ5）的表达上起决定性作用[16,17]。

3 LRIT3蛋白在锥细胞-ON-BCs突触形成及信号传导的特异性作用

锥细胞以内陷的方式与ON-BCs形成突触，以平坦的方式与OFF-BCs联系，其末端释放的谷氨酸盐经过突触丝带弥散至突触后分别与ON-BCs表面的GRM6、OFF-BCs表面的离子型谷氨酸受体（ionotropic glutamate receptor, IGR）相结合［18］，在光刺激下分别使ON-BCs去极化及OFF-BCs超极化。因LRIT3只是对mGluR6、TRPM1的表达、定位起到决定性作用，并不对IGR构成影响，所以LRIT3突变致cCSNB的ERG d波得以保留。

Neuillé 等利用免疫组织化学的方法测得Lrit-3nob6/nob6大鼠模型锥细胞-ON-BCs树突数目减少，神经节细胞ON-反应相应减弱［19］，锥细胞-OFF-BCs树突数目相对增加，突触丝带发生拥挤，谷氨酸盐摄取障碍表现为OFF-d波峰时延迟。与人LRIT3突变致cCSNB的OFF反应无变化不一致，推测其由不同物种锥细胞系统存在差异引起。LRIT3蛋白对锥细胞与ON-BCs突触的形成、突触数量及对ONBCs信号传导通路有特异性作用。

因cCSNB可以表现为X连锁隐性遗传及常染色体隐性遗传［2］，突变检出率较低，其眼底表现多正常，无视网膜色素沉着，伴或不伴后极部椭圆体带的变薄；目前对NYX、GRM6、TRPM1和GPR179突变的研究已较为成熟，LRIT3为近年来新检测出的突变基因，编码的LRIT3在中枢及视网膜均有表达，由于LRIT3的双极性及含有多种跨膜功能结构域的特点，其在细胞表面分子标记物的跨膜转运及突触间递质传递有调节作用。在光感受器细胞特别是锥细胞与ON-BCs突触形成及信号转导方面有特异性作用。LRIT3突变致突触后mGluR6、TRPM1表达的缺失，致使ON-BCs无法去极化，b波无法产生，从而出现稳定无进展的夜盲症状及高度近视、眼球震颤及色觉异常等临床表现，对于LRIT3突变现多停留在动物实验阶段，未来需要进一步阐明其在先天性静止性夜盲上的发病机制。