分子生物学方法在肠球菌耐药性研究中的应用

郭嫔

（山东畜牧兽医职业学院，山东 潍坊 261061）

0 引言

肠球菌属于一种革兰阳性菌，其发生感染率仅次于葡萄球菌，人体感染肠球菌之后很有可能会导致伤口感染、泌尿系统感染、腹膜炎、败血症、心内膜炎等疾病。而且目前万古霉素耐药肠球菌正在逐渐增加，所以临床上在治疗以上类型疾病的过程当中也存在着较大的困难。目前，我国对肠球菌耐药性的研究已经到达了分子水平，所以分子生物学方式是研究肠球菌耐药性的主要方式之一，本文就针对分子生物学方法在肠球菌耐药性研究中的应用进行了分析，以下为具体内容。

1 飞行时间质谱和聚合酶链反应

聚合酶链式反应主要是一种能够在人体外模拟自然DNA复制的核酸扩增技术，我国实验室在进行肠球菌属鉴定的过程当中主要通过生化实验鉴定表型，其中主要包括API法和VITEK革兰阳性菌鉴定系统[1]。各种方式能够在24小时内得到结果，但是可靠性相对不够，主要的原因是由于非典型的种属和目前生化试验设计无法相一致，或者试剂盒对于新种属并没有建立一个新的鉴定方式，针对这个问题，分子生物学方法就能够解决。目前通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱的方式可以有效快速的鉴定肠球菌属，而且所耗费的成本也比较低，具有较高的应用价值。为了建立肠球菌van的基因分型和鉴定方法，gurtler等人发展了两种可用于高分辨率融合曲线pcr（hrmpcr）技术的多重pcr反应，检测不同种类的van基因，得到特异性的曲线。

2 Southren杂交技术

Southren杂交技术主要是在1975年被提出来的，相关的操作步骤比较复杂，但是在进行VRE研究的过程当中，可以依照《分子克隆》的相关步骤结合自身试验的相关数据就可以进行了[2]。Southren杂交技术还可以进行vanA基因的鉴定，一般来说vanA基因存在于肠球菌的质粒上，鉴定的时候可以通过提取肠球菌质粒的DNA，通过限制性内切酶RCORI消化质粒DNA，设计出有关vanA基因的探针，随后进行Southren杂交技术就能够确定vanA基因的位置。Southren杂交技术还能够构建一个肠球菌质粒的限制性内切酶图谱，针对不同的耐药基因可以设计出不同的特异性引物，随后进行Southren杂交技术的探针，通过定位就可以确定耐药基因在限制性内切酶图谱的位置。

3 脉冲场凝胶电泳

脉冲场凝胶电泳主要是一种应用在分离大分子量线状DNA中的方式，一般来说肠球菌PFGE的周期在5~7天[3]，所以进行脉冲场凝胶电泳的方式主要分成了四个步骤。第一，进行细菌基因组DNA的制备，主要包括收集菌体、增菌、低熔点琼脂糖制作细菌包埋胶块、蛋白酶K消化、溶菌酶溶解细菌细胞壁、多次加洗液等，以上制备工作主要花费3天左右，通过包埋胶块的方式可以将细菌在4℃下保存1个月。第二，进行限制性内切酶酶切。选择Smai肠球菌，在25℃的水中浸泡一夜。第三，进行脉冲场凝胶电泳。选择实验室需要的仪器，由于不同仪器的电泳条件是不同的，所以可以进行事先预实验。一些学者先通过伯乐公司CHEF Mapper system 的PFGE仪器，该仪器的电泳条件为1g/dl琼脂糖，0.5%×TBE buffer，时间调整为1~23s。实验的过程中必须要重视脉冲场凝胶电泳这一步骤，这一步骤虽然看似简单，但是是决定整个实验成功与否、准确与否的关键，主要原因是在进行电泳的时候，DNA会随着活动的进行而出现降解的问题，从而导致条带模糊或者不存在条带情况的出现，针对这个问题可以在配置电泳液的时候加入100μmol/L的硫尿[4]。第四，进行溴化乙锭染色和成像。这个步骤所耗费的时间周期比较长，所以要提高重视程度。

在进行流性疾病研究的时候，为了节省时间，在短时间内判断出是否存在VRE爆发的情况，可以通过改进的快速分型法进行VRE的PFGE工作。主要包括以下几种步骤。第一，50mmol/L Tril HCI（PH80），50mmol/L EDTA，1250U/ml变溶菌素，25mg/ml溶菌酶，15mg/ml蛋白酶K，环境条件为37℃，时间为10分钟。第二，0.5mol/L DTA，1g/dl十二烷基肌氨酸钠，400μg/ml蛋白酶K，环境条件为55℃，时间为2小时，水洗，50℃水洗10分钟，一共操作3次。TE洗，环境条件为50℃，时间为10分钟，次数为3次。第三，Smai（30U），25℃酶切，时间为2小时。第四，电泳时间为20小时，EB染色和成像进行25分钟，时间一共约话费28小时。相关研究人员在进行研究的时候一定要注意，快速分型法虽然比较简便，耗费的时间也比较短，但是对于操作者的技术要求和熟练度要求都比较高，所耗费的试剂成本也比较高，所以要在开始之前考虑清楚[5]。

4 多位点基因序列分析

多位点基因序列分析法是一种具有高分辨能力的分子生物学方式，可以通过序列不同的变化来反映不同菌株之间的进化关系，在进行分子进化学研究中发挥着重要的意义。在研究肠球菌的过程中，主要研究内容包括粪肠球菌和屎肠球菌，通过多位点基因序列分析法，可以在本地的实践结果提交数据库以及大型数据库的国际网站进行查询或比较，具有一定的便捷性。粪肠球菌和屎肠球菌的主要序列组成包括7个管家基因，主要为gdh，gyd，psts,gki，aroe，xpt,yiql[6]，根据不同实验室的数据以及肠球菌的分型来为其提供相应的方式，这样多位点基因序列分析数据库就能够为全球的流行病研究提供相应的数据，对于在全世界范围内传播的多重耐药的肠球菌克隆株进行识别和跟踪。

5 焦磷酸测序法在肠球菌耐药机制分析

在细菌耐药机制的研究中，许多案例需要验证已知dna片段的序列，而这种分析可以通过测量几十个bp来满足，双脱氧核苷酸法和化学法可能不是最合适的方法。焦磷酸测序技术是1987年发展起来的一种新型酶连锁串联测序技术。焦磷酸测序法适用于已知短序列的测序。此外，它具有快速、准确、经济、实时检测的特点，不需要凝胶电泳，不需要对dna样品进行任何特殊形式的标记和染色，并且具有较高的并行性和自动化程度。目前，它在细菌耐药机制的研究中还没有得到广泛的应用，但有一定的发展空间。

肠球菌，尤其是屎肠球菌，通常具有多重耐药性，由它们引起的严重感染的治疗可能存在问题。利奈唑胺是一种新型恶唑烷酮类抗生素，能与细菌23srrnaa结合，抑制细菌蛋白质的合成，对葡萄球菌和肠球菌均有高度耐药性。利奈唑胺很罕见，但在使用利奈唑胺治疗过程中可能发生，这与影响23srna肽基转移酶区域的染色体突变有关。利奈唑胺抗性是由多个等位基因编码的23个srna中的g2576t单核苷酸多态性(snp)介导的。采用焦磷酸测序法快速检测snps，检测并评价含有t2576突变的23srns数量。

6 结语

本文所涉及到的这些分子生物学方式主要针对的是肠球菌耐药性所提出的，但是这些方式也可以为其他细菌的耐药性研究提供相应的借鉴和思路。主要对飞行时间质谱和聚合酶链反应、Southren杂交技术、脉冲场凝胶电泳、多位点基因序列分析四种方式进行了分析，四种方式都具有一定的作用和意义，在进行肠球菌耐药性研究方面均提供了相应的借鉴。但是我们在研究的过程当中需要注意，每一种方法都有一定的局限性，也有一定的作用，所以如何发挥不同方式的优势，取长补短，是我们研究的主要目的和意义，也值得继续进行探索。