结核分枝杆菌生物膜的研究进展

宋善敏，甘梦兰，魏怡冰，王恩花

(贵州农业职业学院，贵州 贵阳 551400)

结核病(Tuberculosis，TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium Tuberculosis，MTB)引起的一种慢性传染性疾病，具有发病率高、感染性强、致死率高、高耐药性等特点，以肺部结核最为常见。据WHO发布的《2020年全球结核病调查报告》显示[1]，2019年，全球新发结核病患者约1 000万，发病率为13/万，且约有3.3%的新发患者和17.7%的复治患者对利福平耐药。目前，结核病普遍采用6～9个月的短程督导治疗(DOTs)[2]，大多数患者可以被治愈，但因结核病治疗过程中存在治疗周期长、不规范用药、患者依从性差等因素，导致耐药性结核杆菌出现，给全球结核病控制带来了极大挑战。

研究表明，细菌形成生物膜会增强细菌对宿主免疫系统的抵抗力，且大幅增加抗生素的耐药性(提高10～1 000倍)[3]，大约65%～80%的人类细菌感染与生物膜形成相关[4]。有研究发现MTB能够长期栖居于生物膜内，成为持留菌，可能是引起结核分枝杆菌耐药性增加的重要机制之一。本文就MTB生物膜的概念、形成机制、结构特性、致病性及新研究思路等方面进行简要综述。

1 细菌生物膜的概念

细菌生物膜( bacterial biofilm，BBF)是细菌为了适应自然环境，在生长过程中粘附在附着物表面或破损组织表面而形成的特殊存在形式，是由多个细菌组成的一种膜状结构[5]。结核分枝杆菌在适宜生长的液体培养基中培养一段时间后，在气液交接面会形成有组织、紧密连接的薄膜样结构，即结核分枝杆菌生物膜[6]。

2 MTB生物膜的形成机制

MTB生物膜的形成是一个非常复杂的动态过程，主要有四个步骤[7]。

2.1 黏附阶段

初始附着是细菌形成生物膜最关键的步骤，浮游细菌在疏水性、表面张力及群体感应(QS)的作用下，不断向生物或非生物附着表面靠近。同时，克服来自宿主本身的排斥力，完成初始附着，是一个动态的、可逆的和有选择特异性的黏附过程。

2.2 增殖阶段

细菌在表面附着后，大量分泌细胞外基质(ECM)，ECM包含蛋白质、无机盐、脂质、多糖、细胞外DNA、和RNA等物质，是细菌长期营养缺乏期间的营养来源。此时细菌快速生长繁殖并分泌胞外多糖(EPS)，促使细菌之间相互聚集、增加细菌黏附的牢固程度，不断粘结浮游细菌，形成微小菌落。

2.3 成熟阶段

形成微小菌落后，EPS不断粘连微小细菌，使生物膜加厚，最终形成一个紧密结合、相互连接的三维(3D)立体薄膜结构，包括水通道和气孔等复杂结构，作为营养物质、水分、代谢产物的运输通道。

2.4 分散阶段

细菌形成成熟生物膜后，细菌不断聚集累积，生存环境变得拥挤，在基因调控和外部冲刷力作用下，部分细菌会解聚和脱离，重新变成浮游细菌，寻找新的黏附表面，重复初始附着、生长增殖、生熟分散这一过程，这也是导致细菌扩散感染的重要原因。

3 MTB的结构特性

MTB生物膜的形成过程、调控方式、耐药机制之所以十分复杂，是因为生物膜具有细胞表面疏水性、流动性、不对称性、选择通透性和单纯扩散等结构特性。Cohengonsaud等[8]发现细胞表面疏水性是决定细菌黏附的关键，其赋予了细菌表面的粘附性，是生物膜的形成和导致致病性的基础。杨福愉等[9]发现，生物膜上大部分类脂、膜蛋白分子处于不断流动状态，可以影响物质运输、细胞运动和信息传递等。细菌生长所需要的营养物质及其他必须物质，进入生物膜内取决于膜两侧浓度差，并以单纯扩散方式过膜。

4 MTB生物膜与致病性的关系

4.1 影响药物敏感性

膜内菌与浮游细菌相比，EPS可选择性的通过无机盐和营养物质，造成膜内微环境差异，例如局部营养物质缺乏、形成厌氧环境等，使膜内菌出现部分被杀死、部分生长缓慢或休眠等情况，极大降低了对抗生素药物的敏感性，必须加大给药量，表现出更高的耐药性。

4.2 对抗机体免疫防御

浮游细菌很容易被人体自身免疫系统清除或被高浓度抗生素杀死，但膜内持留菌在生物膜的保护下，抗生素被屏蔽，浓度不足以杀死膜内菌，且可以逃避吞噬细胞吞噬或对抗宿主免疫系统攻击。膜内细菌继续以低代谢、休眠状态存活，但当抗生素压力降低或环境再度适宜生存时，膜内菌结束休眠并恢复生长，再次散播感染病灶，造成结核病的复发。

5 以MTB生物膜为靶点缩短结核治疗时间的新思路

5.1 抑制MTB生物膜的形成

MTB生物膜EPS中富含脂质游离分枝菌酸、多糖、脂质、蛋白质等，通过干扰关键组分，抑制生物膜形成。Xavier等[10]发现酯酶、多糖解聚酶等的促解离剂可能会破坏EPS合成，影响细菌黏附；Ojha等[11]发现基因GroEL1参与耻垢分枝杆菌生物膜分枝菌酸合成，突变后会影响MTB细胞壁形成；Trivedi等[12]发现MTB关键多糖纤维素的降解干扰EPS合成，减弱微小细菌的附着，进一步影响或破坏生物膜的形成。

5.2 影响MTB生物膜的生长

MTB生物膜的生长过程受多种环境因素影响，包括温度、渗透压、pH和CO2等，通过改变生长环境，影响MTB生物膜生长。Ojha等[ 13]建立了MTB生物膜体外培养模型，发现当培养基中CO2积累达44 amu时，会刺激生物膜生长；Banin 等[14]研究发现铁在生物膜的形成中起关键作用，Ojha等[ 15]进一步研究证明，低含量铁和锌都能抑制MTB生物膜生长发育。

5.3 清除MTB成熟生物膜

对于成熟生物膜，通过影响EPS结构，减弱生物膜的结构质量，可加速生物膜降解和清除，但目前MTB生物膜降解清除相关研究较少。肖倩等[16]发现中药黄芪、穿心莲及抗菌肽LL-37单独应用均能够早期抑制铜绿假单胞菌生物膜的形成，在一定程度上可清除成熟的生物膜；You等[17]、何谷良等[18]研究发现盐肤木乙醇提取物MIC值高于0.05 g/L、黄芩提取物黄芩苷高于0.5 g/L时，对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生物膜(MRSA)均有显著的清除作用。

6 结语

目前，尽管在结核病基础治疗、预防及诊断等方面研究均有很多突破，但结核病治疗形势依然严峻，耐药结核病愈演愈烈，结核病依旧是最具破坏性的细菌性疾病之一。在结核病治疗中，一旦形成生物膜，膜内MTB会以低代谢、休眠状态存活，逃逸宿主的免疫清除，导致细菌对异烟肼和利福平的耐药性会大幅度提高，延长疾病治疗时间。通过有效抑制MTB生物膜形成、生长，或清除已有生物膜以缩短结核治疗时间是治疗结核病的新思路。但MTB生物膜的形成机制与体内生长环境、免疫系统的关系尚未明确，相关研究也仅局限于体外实验。因此，今后我们仍需更深入研究MTB生物膜相关方面，争取早日攻克这一难题。