具栖冬青苷对大鼠急性心肌缺血/再灌注损伤的保护作用研究

杨爱萍，张启春，宋 祎，杨 梦，王君阳，王 畅，胡立宏，王吓长

(南京中医药大学江苏省中药功效物质重点实验室，江苏 南京 210023)

急性心肌梗死作为临床上较常见的急危重症，是冠状动脉急性、持续性缺血缺氧引起心肌坏死的一类疾病，具有发病快，致死致残率高等特点[1, 2]。随着溶栓疗法以及心外科技术的进步，急性心肌梗死患者的死亡率在逐渐减低，但缺血/再灌注后中断的血流突然恢复，随之产生的一系列如再灌注心律失常、微循环障碍、心肌顿挫以及部分心肌细胞损伤进行性加重等不良反应仍然给患者带来严重的伤害[3-6]。心肌缺血/再灌注损伤(myocardial ischemia/reperfusion injury，MIRI)作为心血管疾病近年来研究的热点之一，寻找药物预处理来对抗MIRI是目前临床工作中亟待解决的问题。

救必应为我国南方常用中药，始载于《岭南采药录》，为冬青科植物铁冬青(IlexrotundaThunb.)的干燥树皮或根皮。早期文献报道，救必应提取物具有降低血压，减慢心率，缓解心绞痛，预防冠心病，抗缺氧，抗心律失常以及抵抗心肌缺血的作用[7-8]。具栖冬青苷(pedunculoside，PE)为救必应的活性成分之一[9-10]，结构式见Fig 1，其对MIRI的治疗作用目前未见报道。本实验通过结扎大鼠心脏冠状动脉左前降支(left anterior descending coronary，LAD)30 min，再灌注24 h的方法建立大鼠MIRI模型，研究具栖冬青苷预处理对MIRI的保护作用，并探讨其可能的机制，为临床寻找更好的心肌保护药物提供参考。

Fig 1 Chemical structure of pedunculoside (PE)

1 材料

1.1 实验动物健康成年SD大鼠，SPF级，♂，体质量(300±30) g，由江苏省南京市青龙山实验动物养殖场提供，动物许可证号：SCXK(苏)2017-0001，合格证号：20180004025638。

1.2 药物和试剂具栖冬青苷(实验室自制，纯度99.5%，白色粉末，易溶于甲醇和DMSO，可溶于水，常温保存)；卡托普利片(批号20180306，中美上海施贵宝制药有限公司)；酒石酸美托洛尔片(批号20171208，阿斯利康制药有限公司)；戊巴比妥钠(批号20161202，上海市惠兴生化试剂有限公司)；肝素钠(批号421F027，南京森贝伽生物科技有限公司)；2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC，批号20160901，南京森贝伽生物科技有限公司)；伊文思蓝(批号20170305，南京森贝伽生物科技有限公司)；丙二醛(malondialdehyde，MAD)试剂盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)试剂盒、心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I，CTnI)试剂盒均购于南京建成生物工程研究所，批号20200801。

阳性对照药美托洛尔、卡托普利和受试药物具栖冬青苷均采用0.5%羧甲基纤维素钠配制的混悬液进行灌胃给药，药物当天配制，现配现用。

1.3 主要仪器设备小动物呼吸机(型号AE02-ALC-V8S，上海奥尔科特生物科技有限公司)；Power Lab(型号PL3508B73，上海赞德医疗器械有限公司)；酶标仪(型号M200 Pro Nanoquant，上海帝肯贸易有限公司)；冷冻离心机(批号Auegra X30R，Beckman公司)；电子天平(型号OHAUS，苏州塞恩斯仪器有限公司)。

2 方法

2.1 动物分组及处理SD大鼠购入后在室温23 ℃-26 ℃，相对湿度40%-60%环境下饲养7 d，期间自由进食饮水。术前选取体质量在(300±30) g的大鼠，随机分成7组，即假手术组(Sham)、急性心肌缺血/再灌注损伤模型组(M)、卡托普利组(Capt，12.5 mg·kg-1，阳性药)、美托洛尔组(MT，15 mg·kg-1，阳性药)、PE低、中、高剂量组(2.5、5和10 mg)，每组大鼠10只。

2.2 实验模型的制备大鼠称重，用2%戊巴比妥钠溶液(60 mg·kg-1)行腹腔注射麻醉，观察大鼠反应，待角膜反射、肌张力消失后，置鼠板仰卧位固定。剪去大鼠颈部正中、左前胸的体毛备皮，碘伏消毒。先实施颈部开口，暴露气管，于视觉可见下连接小动物呼吸机，设置呼吸频率为90次/min，潮气量为3 mL/100 g，观察2 min。待大鼠呼吸平稳后，打开Powerlab，将针式电极固定于大鼠四肢皮下, 以监测肢体Ⅱ导联心电图的变化。并于左胸前第3-4肋间逐层开胸，分离心包，暴露心脏，于肺动脉圆锥和左心耳间找到左冠状动脉前降支LAD，用丝线于左心耳下缘2 mm处以活结结扎，附带结扎自制导管。以Ⅱ导联心电图采集的图像中ST段明显抬高，结扎点以下部位心肌色泽瞬时变苍白，或发生区域性心肌运动障碍，即为LAD结扎成功的标志[11-14]。结扎30 min后，打开活结，去掉自制导管，恢复血液供应，实现血液再灌注。随后，立即用棉球小心拭去胸腔积水，轻轻调整心肺正常位置，逐层缝合伤口，缝合时胸腔预留自制抽气导管，待拉紧缝合线关闭胸腔后，抽气并拔出导管以恢复胸腔的负压状态。整个再灌注过程持续24 h，24 h后进行各指标检测。假手术组大鼠同模型组大鼠手术过程，但仅在LAD下留置丝线，不进行结扎和再灌注手术。术后观察大鼠心电图，如无心律失常、室颤等异形波形图，且呼吸平稳，可小心去掉呼吸机，缝合颈部皮肤。将大鼠置宠物电热毯保暖至麻醉消退意识恢复。

2.3 给药方法大鼠术前3 d连续灌胃给药，每日1次，每次灌胃以当天体重计算，灌胃体积10 mL·kg-1。模型组、假手术组给予0.5%羧甲基纤维素钠溶液。其余各组分别给予PE低、中、高剂量(2.5、5和10 mg·kg-1)、阳性对照药卡托普利12.5 mg·kg-1、阳性对照药美托洛尔15 mg·kg-1。末次给药2 h后开始急性心肌缺血/再灌注损伤手术操作。

2.4 指标检测

2.4.1Ⅱ导联心电图 记录各组大鼠的Ⅱ导联心电图，观察缺血性心律失常的发生，并记录缺血/再灌注后ST段高度的变化。

2.4.2血流动力学 连接生物信号采集系统Power Lab、压力换能器及聚乙烯导管，用0.1%肝素钠生理盐水冲洗并充盈导管，排空气泡备用。分离大鼠右颈总动脉，根据显示器所示压力图形的变化，将含0.1%肝素钠的导管缓缓插入左心室，监测大鼠左心室血流动力学的变化，评估心脏收缩及舒张功能。观察指标包括左心室收缩压(left ventricular systolic pressure，LVSP)、左心室舒张末期压(left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)、左心室等容期压力最大变化速率(the maximum rate of pressure rise and fall，±dP/dtmax)。

2.4.3心肌梗死面积 待再灌注结束后，将2 mL 1%伊文思蓝由主动脉注入左心室染色，区分非缺血区(蓝染区)与缺血区(非蓝染区)。然后迅速处死大鼠，取出离体心脏，用冷的磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次，挤出心脏内部液体，滤纸吸干心脏表面水分，称量心脏重量，用于心脏脏器指数计算。置-80 ℃冰箱冷冻10 min后取出，将心脏横切成2 mm厚的切片，置于1% TTC溶液中，37 ℃恒温避光染色20 min，区分缺血未梗死区(砖红色)和梗死区(灰白色)。TTC染色后将心肌切片放入4%的多聚甲醛溶液中固定24 h。心肌切片拍照后，采用电脑图像分析软件Image Pro Plus测定心肌梗死面积百分比/%=(心肌梗死区面积之和/心肌缺血区面积之和)× 100%。

2.4.4心脏脏器指数 心脏脏器系数=(心脏重量/体重)× 100%，体重为末次给药体重。

2.4.5血清中SOD、MAD、CTnI含量测定 测定血流动力学后，大鼠颈动脉取血4 mL，4 ℃静置1 h，以3 500 r·min-1低温离心10 min，分装血清于EP管中，-80 ℃保存。测定时取出血清，快速解冻，严格按照试剂盒说明，测血清中SOD、MAD和CTnI的含量。

3 结果

3.1 具栖冬青苷对急性心肌缺血/再灌注大鼠心电图ST段高度的影响SD大鼠在结扎LAD后，可见S波消失，ST段明显抬高，经血液再灌注24 h后，ST段略降低，但各组间未见显著性差异，见Fig 2。MIRI模型制备过程中有5只大鼠因心律失常死亡而舍弃，建模成功率大于90%。

Fig 4 TTC staining of myocardial sections in rats

Fig 3 Evens blue staining of whole heart in rats

Fig 2 Changes of electrocardiogram of MIRI model ratsA： Normal electrocardiogram; B： After LAD ligation; C： 24 h after reperfusion

3.2 具栖冬青苷对急性心肌缺血/再灌注大鼠血流动力学的影响与假手术组比较，MIRI组大鼠LVSP和+dP/dtmax下降，LVEDP和-dP/dtmax上升，差异均有显著性(P<0.01)，说明模型组大鼠心脏舒张功能和收缩功能明显受损；与模型组比较，卡托普利组、美托洛尔组、具栖冬青苷中、高剂量组LVSP升高；卡托普利组、美托洛尔组、具栖冬青苷高剂量组+dP/dtmax升高；卡托普利组、具栖冬青苷高剂量预处理组LVEDP和-dP/dtmax降低，差异存在显著性(P<0.05)；提示具栖冬青苷预处理有改善急性心肌缺血/再灌注损伤后心肌收缩及舒张功能的作用，结果如Tab 1所示。

Tab 1 Effects of pedunculoside on hemodynamics in MIRI rats

3.3 具栖冬青苷对急性心肌缺血/再灌注大鼠心肌梗死面积的影响各组大鼠经LAD结扎30 min，再灌注24 h后，整体心脏用伊文思蓝染色后，除假手术组外，其他各组大鼠结扎线以下可见缺血区(非蓝染区)，其中模型组缺血区域比较明显，见Fig 3。心肌切片用TTC染色后，同样模型组梗死区(灰白色区)较明显，见Fig 4。

与假手术组相比，心肌缺血/再灌注模型组大鼠心肌梗死面积明显增加(P<0.05)；与模型组相比，卡托普利组、美托洛尔组、具栖冬青苷低、中、高剂量组心肌梗死面积明显降低(P<0.05或P<0.01)，且具栖冬青苷高剂量组的效果比低剂量的效果更明显，提示具栖冬青苷预处理可缓解心肌缺血/再灌注后的心肌梗死，见Fig 5。

Fig 5 Effects of pedunculoside on myocardial infarct size in MIRI rats*P<0.05，**P<0.01 vs MIRI Model; ##P<0.01 vs Sham operation.

3.4 具栖冬青苷对急性心肌缺血/再灌注大鼠心脏脏器指数的影响模型组大鼠心脏脏器指数相对假手术组明显升高(P<0.05)。与模型组比较，卡托普利组、美托洛尔组、具栖冬青苷中、高剂量组MIRI大鼠心脏脏器指数降低，差异有显著性(P<0.05)，提示具栖冬青苷预处理能有效减轻心肌缺血/再灌注损伤后的心脏组织炎性水肿。见Fig 6。

Fig 6 Effects of pedunculoside on HW/BW ratio in MIRI rats#P<0.05 vs Sham operation; *P<0.05 vs MIRI Model.

3.5 具栖冬青苷对急性心肌缺血/再灌注大鼠生化指标的影响与假手术组相比较，模型组血清SOD活性降低，差异有显著性(P<0.01)；同时，MDA、CTnI水平增高，差异亦有显著性(P<0.05)，说明模型制备成功。与模型组相比，卡托普利组、美托洛尔组、具栖冬青苷中、高剂量组大鼠血清SOD活性明显提高，差异有显著性(P<0.05或P<0.01)；卡托普利组、美托洛尔组、具栖冬青苷低、中、高剂量组大鼠血清MDA含量均降低，差异有显著性(P<0.01或P<0.05)；CTnI含量卡托普利组、美托洛尔组、具栖冬青苷高剂量组明显提高，差异有显著性(P<0.05)，见Tab 2。

Tab 2 Effects of pedunculoside on level of SOD, MDA and CTnI in MIRI rats n=10)

4 讨论

心肌缺血/再灌注损伤的发生是一个复杂的病理生理过程，严重者可导致心律失常、心肌顿挫、微血管受损及不可逆的细胞坏死和凋亡等。造成急性心肌缺血后再灌注损伤的机制主要包括微循环障碍、炎症作用、心肌间质水肿、钙超载、白细胞侵入以及酸中毒等方面[15-16]。心肌缺血/再灌注损伤程度与心脏左室功能密切相关，血流动力学指标LVSP、LVEDP、±dP/dtmax是反应心脏收缩和舒张功能的重要指标。定量组织学方法测定心肌梗死面积是心肌缺血研究最直观的评价指标。SOD、MDA、CTnI是心肌损伤的标志物[17]。心肌细胞受损、细胞膜完整性破坏后，心肌酶等便会外漏释放入血，临床常以此诊断心肌损伤程度。SOD是机体内一种重要的抗氧化酶，MIRI时，SOD活性降低，导致氧自由基大量堆积，从而造成心肌损伤，使血清CTnI含量升高，同时，脂质过氧化产物MDA含量升高。基于中药救必应前期在心血管疾病治疗作用方面的研究报道，开展其主要活性成分具栖冬青苷抗MIRI药效学研究，为临床寻找更好的心肌保护药物提供参考。

本实验根据急性心肌缺血/再灌注损伤疾病的特点，通过结扎LAD 30 min，再灌注24 h制备大鼠急性心肌缺血/再灌注损伤模型，选择临床一线治疗药物β-受体阻滞剂美托洛尔与血管紧张素转化酶抑制剂卡托普利作为动物实验的阳性对照药，从心电图、血流动力学、心肌梗死面积、心脏脏器指数、血清生化指标等方面探讨具栖冬青苷的心肌保护作用。结果表明，与MIRI模型组比较，具栖冬青苷预处理组①心电图ST段高度明显降低，提示具栖冬青苷预处理可缓解心肌缺血及再灌注后心肌组织损伤；②血流动力学指标明显改善，表现为LVSP和+dP/dtmax升高，LVEDP和-dP/dtmax降低，提示具栖冬青苷预处理对MIRI大鼠左室收缩和舒张功能有保护作用；③心肌梗死面积明显下降，提示具栖冬青苷可减少心肌细胞持续坏死；④心脏脏器指数降低，提示具栖冬青苷可减少缺血/再灌注后心肌组织的炎性水肿，降低炎症反应；⑤反应心肌损伤程度的CTnI水平降低，SOD活性升高，心肌组织过氧化产物MDA含量降低，提示具栖冬青苷预处理可降低心肌细胞损伤，且在众多指标的改善上并不弱于阳性药卡托普利和美托洛尔。综上可见，具栖冬青苷对急性心肌缺血/再灌注损伤有明显的保护作用。这种保护作用可能与具栖冬青苷预处理增强SOD清除氧自由基能力，降低过氧化物MDA的生成，抑制心肌细胞凋亡，抵抗缺血/再灌注损伤后的心肌细胞持续性坏死，保护保护心脏功能相关；其详细作用机制有待进一步研究。