IL-4 基因甲基化在支气管哮喘患儿及健康儿童中的表达差异

马泽南，顾利华

1.苏州市吴中人民医院儿科，江苏苏州 215128；2.苏州市吴中人民医院麻醉科，江苏苏州 215128

支气管哮喘是一种以气道慢性炎症为特征的异质性疾病[1]，它主要是通过多种细胞（例如肥大细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、T 淋巴细胞、以及气道上皮细胞等等）与细胞组分参与的，此类慢性炎症和气道高反应性有密不可分的关系，可逆性呼气气流受限是出现频率较高的表现症状，具有广泛、多变性，一般在夜晚与早间发作，严重程度也会加剧，大部分患者能够通过治疗改善或者自行减轻。倘若没有及时诊治支气管哮喘，随着时间不断发展，可能会出现气道不可逆性缩窄与气道重塑[2-3]。距现在的研究调查发现，它的主要病因与遗传有关，群体患病率要低于哮喘患者的亲属，而且患病率和患病的严重程度随着亲缘关系越来越近，患病率也会越来越高，这两者呈正比增长的趋势[4]。该研究方便选取该院2016 年3 月—2019 年2 月收治的54 例支气管哮喘患儿及54 名进行门诊体检的健康儿童为研究对象，用甲基化特异性聚合酶链反应检测IL-4 基因甲基化在支气管哮喘患儿及健康儿童中表达差异展开分析，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

为研究IL-4 基因甲基化在支气管哮喘患儿及健康儿童中的表达差异，方便选取该院收治的支气管哮喘患儿54 例作为研究组，年龄5～12 岁，平均年龄为（7.0±1.5）岁；另选取同期该院进行门诊体检的健康儿童54名作为对照组，年龄6～11 岁，平均年龄为（7.0±1.2）岁。两组儿童在年龄上差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。该研究经患儿及健康儿童的家属知情同意。

1.2 诊断标准

进行确诊时，要以中华医学会呼吸分会规定的，关于支气管哮喘的诊断标准为依据。支气管哮喘具有以下临床表现：①发作时伴有发作性咳嗽和胸闷症状，常常会出现呼气性呼吸困难，夜间及凌晨发作和加重[5]。②干咳或咳大量白色泡沫痰，甚至出现发绀，哮喘症状发作的时间一般在数分钟以内，在经过数小时到数天之后，可以通过支气管舒张剂减轻症状，或者自行等待症状的缓解，在症状缓解数小时后，部分病患可能会再度发作。此外，在确诊时，要一一排查，确保不是由于其他疾病造成的胸闷、气急和咳嗽，最后就可以确诊为支气管哮喘。

1.3 测定3IL-4 基因甲基化的方法

1.3.1 提取1DNA 取研究组和对照组儿童的抗凝血各5 mL，用苯酚-氯仿法提取其中的DNA，在提取好DNA之后，对其含量与纯度进行检测，检测工具选择分光光度仪与琼脂糖凝胶电泳。

1.3.2 修饰2DNA 用亚硫酸氢钠处理并纯化经过提取得到的DNA，并放置-20℃的冰箱中，操作严谨，加入水（浓度为1%）100 mL，再加入6.8 μL 的NaOH（浓度为1 mol/L），摇匀，反应在50℃条件下进行15 min，然后加入558 μL 的修饰试剂Ⅰ混合，在50℃条件下反应5～14 h，再加入试剂Ⅲ并摇匀，在试管中的液体中放入试剂Ⅱ700 μL 以及试剂Ⅱ5 μL，并摇匀，在室温下反应10 min，之后用5 000 r/min 的离心速度离心10 s，直到形成沉淀，并去掉上清液，再加入1 mL 的乙醇（70%）震荡，用之前的离心速度离心8 s，也去掉上清液，重复操作3 次后再用之前的离心速度离心2 min，去掉上清液，完成对DNA 的修饰。

1.3.3 检测甲基化的方法 经过亚硫酸钠对基因组DNA 的修饰，依照甲基化与非甲基化序列的引物进行设计，采取PCR 扩增。

1.3.4 PCR 扩增方法 被修饰后的DNA1.8 μL 1.8×PCR 9.8 μL，甲基化上游引物1.1 μL，甲基化下游产物1.1 μL，灭菌双蒸水6.2 μL，总共20 μL。IL-4 引物扩增条件；95℃预变性6 min，再变性20 s，50℃退火20 s，70℃延伸20 s，循环25 次，70℃再延伸50 s。把扩增产物放于4℃条件下，利用紫外凝胶成像系统，对图像分析的结论进行扫描与采集。

1.4 判定5MSP

倘若有290 bp 扩增条带在IL-4 基因甲基化引物中出现，认为甲基化存在，若291 bp 扩增条带在非甲基化引物中出现，则认为非甲基化存在。

1.5 统计方法

数据选用SPSS 21.0 统计学软件进行分析。计数资料以[n(%)]表示，组间差异比较采用χ2检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MSP 的结果

在进行MSP 检测过程中，甲基化引物有290 bp 扩增条带产生，非甲基化引物则有291 bp 扩增条带产生，可以在IL-4 基因甲基化电泳图谱中清楚地观察到。

2.2 比较研究组与对照组的甲基化率

研究组的IL-4 基因完全甲基化率为31.48%（17/54），未甲基化率为18.52%（10/54），甲基化与未甲基化的共存率为50%（27/54），对照组的IL-4 基因完全甲基化率为14.81%（8/54），未甲基化率为44.44%（24/54），甲基化与未甲基化的共存率为40.74%（22/54），研究组的甲基化率与对照组的甲基化率差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 两组患儿IL-4 基因甲基化率比较[n（%）]

3 讨论

支气管哮喘病发生的因素除了遗传因素之外，还有一些变应原的因素导致小儿发生支气管哮喘。最常见并且危害最大的室内变应原是尘螨，是世界范围内哮喘发病的重要原因[6]，而最普遍的导致哮喘发作的室外变应原是花粉和草粉，还有其他各种特异以及非特异性吸入物，比如：二氧化硫、动物毛屑和氨气等。而谷物粉、茶、咖啡豆、家蚕、鸽子、蘑菇、抗生素、活性染料、乙二胺等属于常见的职业性变应原[7-8]，此外药物导致哮喘的变应原则是普萘洛尔（心得安）、阿司匹林与部分非皮质激素类抗炎药[9]，除此之外，诱发哮喘的因素也包含虾、鱼、蛋类和牛奶等食物。除了以上这些，日常生活中存在的空气污染、吸烟产生的气体，还有气候的变化，或者剧烈运动吸入冷空气，具有感染性的细菌、原虫、病毒以及寄生虫等，这些因素都是引发哮喘发作的原因。

儿童患有支气管哮喘，会升高IL-4 基因甲基化，由此可以发现IL-4 基因甲基化对IL-4 的分泌有促进作用，对IgE 的合成有重要影响，IL-4 基因在静息CD4+中，处于非甲基化，IL-4 甲基化与过敏原接触过后，IL-4启动区甲基化程度升高，使得产生大量IL-4，引起支气管哮喘的发生[5，9-10]。

小儿哮喘发作与呼吸道感染有紧密的联系，特别是病毒和支原体感染。绝大部分婴幼儿哮喘，是呼吸道感染造成的，呼吸道病毒是其主要的病原体，研究证实，喘息是由于合胞病毒感染可因发生特异性免疫球蛋白IgE 介导I 型变态反应而产生的。成人对尘螨的过敏比儿童期要少，尘螨存活的最短适宜季节是春秋季节，所以春秋季节是尘螨性哮喘发作的高峰期，患者多于夜间发作。儿童对外界气候的变化是非常敏感的，比如骤然变冷的气温或者气压的降低，往往都会导致哮喘发作，所以，儿童在春秋两个季节发病率明显较高。也有研究表明哮喘儿童也常受情绪影响，在情绪激动时或其他心理活动障碍时常伴有迷走神经兴奋而引起哮喘发作。

对于儿童哮喘病的治疗，应遵照持续性、规范性、长期性与个体化治疗的原则，处于急性发作期阶段，应该迅速对症状采取缓解措施、进行抗炎治疗、平喘、祛痰、镇静、抗过敏。防止与致敏原进行接触。选用抗生素，在慢性持续期时应防止症状加重，防止气道重塑，加强身体锻炼、合理调节室温、提高自我管理水平、采取药物和非药物结合治疗，多功能治疗防护措施要做好，此外哮喘防治教育、及时处理患儿心理问题、回避变应原、提高生命质量、药物经济学等非药物治疗，对长期管理哮喘能够起到关键作用，不能过分忽视。

研究组的IL-4 基因甲基化率与对照组比较，研究组中的支气管哮喘患儿的IL-4 基因完全甲基化率为44.44%（24/54），未甲基化率为18.52%（10/54），甲基化与未甲基化的共存率为50%（27/54），对照组的IL-4 基因完全甲基化率为14.81%（8/54），未甲基化率为37.04%（20/54），甲基化与未甲基化的共存率为40.74%（22/54），甲基化率差异有统计学意义（P＜0.05），与韩继红等人[11]的研究结果相一致：研究组IL-4 基因完全甲基化率为42.5%(34/80)，未甲基化率为25.0%(20/80)，甲基化和未甲基化共存率为32.5%(26/80)；对照组IL-4基因启动子区完全甲基化率为11.3%（9/80），未甲基化率为46.3%（37/80）；甲基化和未甲基化共存率为42.5%（34/8），重度发病期患儿的IL-4 表达水平明显高于轻度发病期和缓解期。

综上所述，IL-4 甲基化的表达的差异对支气管哮喘的患儿有着一定的影响。