通脉降浊解毒方对缺血性脑卒中大鼠皮质神经生长相关蛋白-43表达的影响研究

李九席，焦红军，任 明

(郑州大学第二附属医院，河南 郑州 450003)

缺血性脑卒中是指由局部脑组织血液循环障碍引起的脑组织供氧、供血障碍，导致的局部脑组织崩解坏死情况[1]。患者轴突往往不能有效再生，导致患者发病后常出现吞咽、语言、认知、运动等功能障碍[2]。积极有效的治疗措施对改善患者受损脑组织功能、提高患者生活质量具有积极意义。临床上通常通过药物治疗及康复训练方式促进患者脑功能恢复，通过给予药物治疗或其他刺激加强内源性神经的修复，并抑制诱导突触与神经元胞体死亡的不良因素，从而促进患者脑功能重塑[3]。研究指出，微环境对神经功能的修复会产生重要影响[4]。神经生长相关蛋白-43(GAP-43)是神经生长于神经元发育的标志蛋白，同时也是缺血性脑卒中病发后轴突生长的标志物，通过观察GAP-43的表达情况，可以对缺血性脑卒中的神经修复过程进行有效判断和评估[5]。本研究旨在探讨通脉降浊解毒方对缺血性脑卒中病灶周围GAP-43表达水平的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康雄性SD大鼠48只，体质量(250±20)g。购自凯学生物科技(上海)有限公司，许可证号：NO.0251284。在18～26 ℃室温、自然光线环境下用无菌蒸馏水与饲料饲养。

1.1.2 药物 “通脉降浊解毒方”组方 陈皮、茯苓、丹参、白芍各20 g，黄芩、柴胡、枳实各15 g，半夏、大黄各10 g，甘草10 g。药材均取自本院中药房，加入8倍量水煎煮2次后过滤去除药渣，制成相当于原生药2 g/mL的水煎液。

1.1.3 仪器与试剂 本次实验主要仪器及试剂信息见表1。

表1 主要仪器、试剂信息

1.2 缺血性脑卒中大鼠模型制备

将48只健康雄性SD大鼠分笼饲养1周，随机将大鼠分为正常组、模型组、药物低剂量组与高剂量组，每组各12只，每组又分为7 d与14 d亚组，各6只，之后采用热凝闭大脑中动脉法制备大鼠模型。首先腹腔注射水合氯醛(0.5 mL/100 g，6%)对大鼠进行麻醉，将其右侧在手术台上固定，去除颞顶左侧鼠毛，并用碘伏与乙醇对局部皮肤进行消毒清洁。于大鼠左耳、左眼间将皮肤切开，进行颞肌分离并使颞骨翼板充分暴露，注意避免对大鼠颞神经造成损伤。采用牙科钻自颞骨翼板通至硬脑膜，在动物手术显微镜下找寻大鼠大脑动脉。用小咬骨钳去除大鼠部分颅骨，使大脑中动脉近端充分暴露。采用电凝器对大脑动脉(近端与大脑下静脉段)进行凝闭，正常组大鼠不用凝闭，之后对大鼠颞肌与皮肤进行缝合。待大鼠苏醒后用Longa评分法对大鼠模型质量进行评估，1～3分表示模型制备成功[6]。Longa评分标准：大鼠无神经损伤表现，记为0分；大鼠手术对侧前、后爪无法完全伸展，记为1分；大鼠行走时朝手术对侧转圈，记为2分；大鼠行走时朝手术对侧倾倒，记为3分；大鼠无法自行行走，记为4分。大鼠Longa评分越高，说明神经功能损伤越严重。

1.3 治疗方法

对正常组及模型组大鼠采用0.9%NaCl注射液灌胃，剂量5 mL/kg，1次/d。低剂量组与高剂量组按照60 kg体重成人用药量10倍、20倍的“通脉降浊解毒方”灌等量药物，1次/d。对各组大鼠实施连续治疗至造模后的第7天、14天，分别进行平衡木行走实验与转棒上行走实验，之后处死大鼠，观察各组大鼠病灶周围GAP-43表达水平。

1.4 实验方法

1.4.1 运动功能检测[7-8]在大鼠连续治疗7 d、14 d后进行平衡木行走实验与转棒上行走实验。平衡木行走实验：选取一条长170 cm、宽2 cm的木棒放置在离桌面7 cm处，让大鼠在平衡木上行走，10 min/d。评分标准：大鼠成功穿过平衡木且未跌倒，记为0分；大鼠可以穿过平衡木，且跌倒概率<50%，记为1分；大鼠可以穿过平衡木，但跌倒概率>50%，记为2分；大鼠可以穿过平衡木，但瘫痪侧后肢不能辅助移动，记为3分；大鼠无法穿过平衡木，但可以坐在平衡木上，记为4分；大鼠无法穿过平衡木，坐在平衡木上会掉落，记为5分。每只大鼠平均进行4～10次测试，根据大鼠的总跌倒次数判断大鼠的跌倒概率。转棒上行走实验：准备一根长150 cm、d=4.5 cm的木棒，将其一端固定于转动器上，转动器转速设置为3r/min，进行左右交替式转动，大鼠在转棒上进行行走、旋转、抓握等运动，10 min/d。评分标准：大鼠在木棒转动过程中可以行走，记为0分；在木棒转动过程中大鼠不会掉落，且能坚持1 min以上，记为1分；木棒开始转动后大鼠会掉落，记为2分；木棒开始转动前大鼠就掉落，记为3分。

1.4.2 GAP-43表达水平检测 各组大鼠在治疗7 d、14 d后进行GAP-43表达检测，腹腔注射水合氯醛对大鼠进行麻醉(0.5 mL/100 g，6%)，将大鼠固定在手术台上，心脏灌注4%多聚甲醛之后断头取脑。切取2 mm包含病灶的大鼠脑组织，用4%多聚甲醛进行固定，并在常规浓度梯度乙醇中进行脱水，在二甲苯Ⅰ、Ⅱ中浸泡后用石蜡包埋，并进行连续切片，取厚5 μm的切片，通过链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶法检测病灶周围GAP-43的表达情况。切片常规脱蜡、水化，并按照试剂盒上的操作说明严格执行各项操作过程。DAB显色镜检，在400倍视野中选取5个不重叠的视野，采用尼康NIS-Elements D 3.0图像获取分析软件测定阳性表达无的光密度积分。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 各组大鼠Longa评分比较

正常组大鼠由于未进行大脑动脉凝闭，神经功能并未受损，故评分用“-”代替。模型组、低剂量组、高剂量组大鼠在治疗7 d后，Longa评分分别为(2.82±0.63)分、(2.20±0.23)分、(1.48±0.13)分；治疗14 d后，Longa评分分别为(2.51±0.44)分、(1.44±0.20)分、(0.81±0.22)分。各组间的同期评分结果，差异具有统计学意义(P<0.05)。Longa评分越高，提示大脑的神经功能受损情况越严重，观察结果可知，3组大鼠在治疗后Longa评分均有所上升，模型组采用生理盐水灌胃，故考虑可能是脑组织正常区域搭建侧支循环通过代偿作用改善病灶部位的缺血、缺氧情况，但大鼠自身代偿能力有限，故Longa评分变化幅度较小。低剂量组与高剂量组治疗14 d的Longa评分明显高于同组治疗7 d时的评分结果，提示通脉降浊解毒方可以有效改善缺血性脑卒中大鼠的神经功能，促进大鼠脑功能重塑。且大鼠神经功能的恢复情况与药物浓度表现出一定的相关性，高剂量药物能够更有效地促进大鼠神经功能恢复。各组大鼠Longa评分比较见表2。

表2 各组大鼠Longa评分比较 分)

2.2 各组大鼠平衡木行走实验与转棒上行走实验评分比较

治疗7 d时，高剂量组大鼠平衡木行走实验与转棒上行走实验评分均明显低于模型组与低剂量组(P<0.05)，模型组与低剂量组比较均无明显差异(P>0.05)；治疗14 d时，低剂量组大鼠平衡木行走实验与转棒上行走实验评分均明显低于模型组(P<0.05)，高剂量组大鼠平衡木行走实验与转棒上行走实验评分均明显低于模型组与低剂量组(P<0.05)，差异具有统计学意义(P<0.05)。平衡木行走实验与转棒上行走实验评分越高说明大鼠的肢体运动障碍越明显，运动能力越差。观察结果可知，3组大鼠在治疗后运动功能均逐渐恢复，模型组大鼠运动功能恢复可能建立在自身出现侧支代谢循环的基础上，运动功能得到小幅度回升。低剂量组与高剂量组治疗14 d的评分结果明显高于同组治疗7 d时的评分结果，说明通脉降浊解毒方可以有效促进大鼠神经功能恢复，从而提高大鼠的运动功能。且大鼠运动功能的恢复情况与药物浓度表现出一定的相关性，高剂量药物能够更有效地促进大鼠运动功能恢复。各组大鼠平衡木行走实验与转棒上行走实验评分比较见表3。

表3 各组大鼠平衡木行走实验与转棒上行走实验评分比较 分)

2.3 各组大鼠GAP-43蛋白光密度积分比较

观察结果可知，GAP-43阳性表达在图像中呈颗粒状，治疗7 d时低剂量组与高剂量组的图像结果较为密集，光密度积分较高，分别为(85.92±9.20)分与(96.83±10.67)分，高剂量组GAP-43蛋白平均光密度积分明显高于低剂量组。正常组与模型组的图像结果相对分散，光密度积分分别为(22.09±3.30)分与(67.46±7.24)分。治疗14 d后，正常组大鼠光密度积分为(22.06±3.32)分，较治疗14 d时无明显变化。其他3组积分较治疗7 d时均发生回落，模型组、低剂量组、高剂量组积分分别为(61.10±6.85)分、(75.56±8.51)分、(82.23±9.38)分，3组间的同期比较结果均存在显著差异，差异具有统计学意义(P<0.05)。高剂量组各时间段的光密度平均积分均为最高，提示通脉降浊解毒方可以有效刺激机体病灶周围GAP-43蛋白表达，且其表达水平与药物浓度表现出一定的正相关性。详见表4。

表4 各组大鼠GAP-43蛋白光密度积分比较 分)

图1 各组大鼠7 d后GAP-43阳性表达(HE染色，×400)

图2 各组大鼠14 d后GAP-43阳性表达(HE染色，×400)

3 结果

缺血性脑卒中是指大脑血管出现闭塞或狭窄导致局部脑组织血流灌注障碍，导致脑组织出现缺血、缺氧性损伤。大脑出现缺血性脑卒中后，谷氨酸会在细胞间隙堆积，局部病灶区域由于缺血、缺氧及炎症反应会引发机体代谢功能紊乱，机体产生与清除自由基的代谢平衡被打破，导致患者出现神经功能损伤[9]。具体表现为患者脑细胞坏死、神经功能与脑组织受损、出现运动功能障碍并伴随各种炎症反应等[10]。通常出现缺血性脑卒中时，机体会通过构建侧支代谢循环的方式改善缺血脑组织的脑神经功能。但机体自身的代偿能力是有限的，往往难以有效改善疾病症状。不良的内环境(如炎性环境)及低下的神经元再生能力都是造成神经系统损伤后预后不良的主要原因[11]。当前临床研究结果表明[12]，抑制性蛋白异常表达、促生长因子水平低下、营养因子缺乏、胶质瘢痕的产生均会对神经功能的修复造成不良影响。

GAP-43是神经组织的特异性磷酸蛋白，在发育或再生的轴突生长锥末端高表达[13]。其能够促进神经细胞分化与轴突生长的作用，并能参与受损神经系统的修复与脑功能重塑过程，具有促进轴突再生、神经细胞生长与突触重建的能力。GAP-43作为轴突生长的分子标志蛋白，在缺血性脑卒中病灶周围通常会呈现出高表达状态。通常情况下，在出现缺血性脑卒中后，GAP-43的表达水平就会立即上升，在7 d时到达峰值。随着神经系统的发育成熟，其表达水平会逐渐回落[14]。中药治疗可以通过调节GAP-43的表达水平，改善病灶周围微环境，从而有效促进受损脑组织的神经功能修复与脑功能重塑[15]。

中医学将缺血性脑卒中归于“中风”范畴，认为其病机在于痰瘀互结、阻于脑窍，痰浊、肝风、瘀血阻窍导致神不导气、窍闭神匿，需治以清热解毒、通脉降浊之方[16]。本次研究选用“通脉降浊解毒方”，其中陈皮理气健脾、燥湿化痰，茯苓健脾宁心、利水渗湿，活血通经、祛瘀止痛，白芍养血调经、平肝止痛，黄芩清热燥湿、泻火解毒，柴胡和解表里、疏肝升阳，枳实破气消积、化痰散瘀，半夏燥湿化痰、消痞散结，大黄逐瘀通经、凉血解毒，甘草调节诸药，可祛痰通络、标本兼治。

徐磊[17]研究发现，针灸与康复训练可以显著提高大鼠GAP-43的表达水平，说明通过康复治疗可以有效促进大鼠受损神经元的轴突修复与突触建立，从而有效提高大鼠神经可塑性，改善大鼠的运动功能与认知功能。陈露露等[18]研究指出活血醒脑开窍方可以通过抑制神经细胞的凋亡过程，增强神经因子表达水平，加强神经系统的调节功能来降低大鼠病灶周围脑组织的炎性反应，提高GAP-43的表达水平，促进大鼠受损脑组织的神经功能修复。2项研究均为在药物或康复治疗作用下，大鼠GAP-43高表达从而改善疾病症状。本次研究结果表明，给予大鼠通脉降浊解毒方可以有效改善大鼠的神经功能，且其表现出一定的药物依赖性，高剂量组大鼠的Longa评分与平衡木行走实验、转棒上行走实验评分均明显高于模型组与低剂量组，说明高剂量组大鼠的神经功能与运动功能恢复情况明显优于同期其他组别(P<0.05)。观察各组大鼠GAP-43表达水平可知，在治疗7 d、14 d时，高剂量组大鼠GAP-43水平明显高于同期其他组，除正常组外，其他组大鼠GAP-43水平在治疗14 d时均发生一定的回落，与上文中讲到的GAP-43在卒中发生后即会出现高表达，7 d时达到峰值，而后逐渐降低的结果一致，说明通脉降浊解毒方可以提高缺血性脑卒中大鼠GAP-43的表达水平，从而有效改善大鼠的受损神经功能，促进大鼠脑功能重塑。

本研究尚存在一些不足之处：研究并未阐明通脉降浊解毒方参与调节缺血性脑卒中的作用机制，仅能通过相关临床研究推测通脉降浊解毒方可以降低病灶血管的通透性，从而减少受损脑组织的含水量，避免水肿使神经细胞受到继发性损害。此外，药物能够有效延缓血管内血栓的形成时间，延缓疾病进一步进展，并提高大鼠抗缺氧能力。通脉降浊解毒方还能促进GAP-43的表达，改善病灶脑组织的微环境，促进受损神经的修复与脑功能重塑。至于通脉降浊解毒方的详细作用机制仍需要学者们进行不断深入探究。

综上所述，通脉降浊解毒方可以促进大鼠受损神经功能修复，改善大鼠神经功能与运动功能，其可能与GAP-43表达水平的上升有关。