芽孢杆菌(Bacillus)FJSC01对烟草土传病原菌的拮抗作用及其鉴定

程 敏, 顾 钢, 肖 顺, 周 挺, 刘国坤

(1.福建农林大学植物保护学院，福建 福州 350002;2.福建省烟草公司烟草科学研究所，福建 福州 350003)

土传病害是指病原体可随病残体在土壤中长期存活，并在合适条件下侵染植物根部或茎部的一类病害[1].长期以来烟草土传病害是阻碍烟草产业发展的重大问题，该类病害包括青枯拉尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)引起的烟草青枯病、胡萝卜软腐果胶杆菌(Pectobacteriumcarotovorum)引起的烟草空腔病、镰刀菌(Fusariumspp.)引起的烟草枯萎病、疫霉菌(Phytophthoraparasitica)引起的烟草黑胫病等[2].化学药剂对于土传病害的防治效果有限，且易导致农药残留、环境污染、根际微生物种群失调和有益微生物种群数量下降等问题[3].利用生防菌抑制土传病原菌和调控植物根系的微生态环境是目前研究的热点[3-5].芽孢杆菌(Bacillus)因其分布广泛、抗逆性强、易分离培养、繁殖快和防效稳定等优点而备受关注，是植物病害生防领域研究与应用最多的细菌之一[3-9].但目前对于芽孢杆菌拮抗菌的筛选，多数只针对单一的靶标土传病原菌.本研究从土传病害根部分离筛选到1株对多种土传病原菌具有拮抗效果的芽孢杆菌FJSC01，通过鉴定及盆栽试验，为开发和研制高效生防制剂或菌肥提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 供试病原菌

尖镰孢菌(F.oxysporum)、胶孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)、立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)、疫霉菌、灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)由福建农林大学线虫实验室提供；病原细菌青枯拉尔氏菌和胡萝卜软腐果胶杆菌由福建农林大学细菌实验室提供.

1.2 芽孢杆菌FJSC01的分离与筛选

从福建青枯病发生严重的番茄田块的轻病株根际土壤中分离到芽孢杆菌FJSC01.分离方法：取土样10 g放入100 mL无菌水中, 在振荡器上振荡40 min， 然后100 ℃水浴3 min，逐级稀释10-1～10-7倍，取0.1 mL涂布NA培养基，28 ℃培养24～48 h后，挑取单一菌落，分离、纯化、编号，在试管NA斜面培养基上保存菌株备用.经初步测试，该菌株对多种靶标土传病原菌具有较好的拮抗效果.

1.3 芽孢杆菌FJSC01平板拮抗效果测定

1.3.1 对5种病原菌的拮抗试验 采用滤纸片法[10]测定芽孢杆菌FJSC01对5种病原菌的拮抗效果：将菌株FJSC01用灭菌蒸馏水配制成浓度为107～108CFU·mL-1的菌悬液，直径6 mm的圆形滤纸片置于直径9 cm的PDA培养基平板中心，吸取6 μL FJSC01菌液点接弥散于滤纸上；然后用消毒后的打孔器(内直径5 mm)打取生长旺盛的5种供试病原菌(尖镰孢菌、胶孢炭疽菌、立枯丝核菌、疫霉菌、灰葡萄孢菌)菌落边缘，将2个菌饼转接于距待测菌液中心2 cm的对称处.每个培养皿放置2个菌饼；以无菌水滤纸片上接种病原菌菌饼为对照，试验重复5次.接种后置于28 ℃培养，待对照组菌落长至培养皿中心点时，测定芽孢杆菌FJSC01对病原菌的抑制率.

1.3.2 对病原细菌的拮抗试验 将分离到的芽孢杆菌FJSC01用灭菌蒸馏水配制成浓度为107～108CFU·mL-1的菌悬液，直径6 mm的圆形滤纸片置于直径9 cm的PDA平板中，以平板中心点为中心，呈3 cm等边三角形状放置，用移液枪吸取6 μL FJSC01菌液点接弥散于滤纸上.分别将浓度为2×108CFU·mL-1的青枯拉尔氏菌和胡萝卜软腐果胶杆菌菌悬液用无菌喷雾器喷于平板上，以只有无菌水的滤纸片喷洒细菌菌液为对照.28 ℃恒温条件下黑暗培养，24 h后观察FJSC01对胡萝卜软腐果胶杆菌的抑菌效果，48 h后观察FJSC01对青枯拉尔氏菌的抑菌效果.用十字交叉法测量抑菌圈直径[10].

1.4 芽孢杆菌FJSC01对烟草青枯病的防治试验

1.4.1 菌液制备 烟草青枯菌菌液制备：将TCC培养基平板筛选的致病性强的青枯菌菌落挑取至NA液体培养基内，在180 r·min-1、28 ℃的摇床中培养48 h，得到发酵菌液.芽孢杆菌FJSC01发酵液的制备：将在NA培养基活化好的菌株FJSC01接种至NA液体培养基内，180 r·min-1、30 ℃摇床培养3 d，得到芽孢杆菌FJSC01的发酵液.

1.4.2 防治效果测定 将烟草包衣种子(福建省烟草总公司提供，品种为K326)播于灭菌的无菌砂土(砂与土的比例1∶1)中，25 ℃温室育苗至3～4片真叶后，将幼苗移栽至直径为20 cm的花盆中，每盆1株，继续温室培养至5～7片真叶时进行接种.期间适时浇施烟草专用肥.

将芽孢杆菌FJSC01发酵液和青枯菌发酵液用无菌水稀释成浓度为3×108CFU·mL-1的菌液，采用灌根法接种于烟草植株：先将芽孢杆菌FJSC01菌液浇灌于烟草植株，每株浇灌50 mL，30 ℃温室培养7 d，然后接种青枯菌菌液50 mL.每个处理重复8次，分别以只接种青枯菌菌液和只接种清水作为阳性和阴性对照.接种完成后，放置在30 ℃的温室中培养，定期浇水以保持湿度，逐日观察并记录植株发病情况，1个月后计算病情指数和防治效果[11].

1.5 芽孢杆菌FJSC01的鉴定

1.5.1 形态特征 参照文献[12-13]的方法进行革兰氏染色和芽孢染色，Nikon显微镜(Eclipse Ni-U 931609)下观察菌体形态.

1.5.2 生理生化特征 采用专用培养基分别开展甲基红、V.P.、柠檬酸盐利用、硝酸盐利用、尿素利用、接触酶产生和吲哚产生等试验[10,12-13].每个处理均设3次重复.

1.5.3 16S rDNA序列分析 用菌悬液沸水浴法提取菌株FJSC01基因组DNA[14]，采用通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′)[15]进行16S rDNA的PCR扩增. DNA模板1 μL，上、下游引物各1 μL，Taq聚合酶12.5 μL，ddH2O补足至25 μL.PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸3 min，共30个循环；72 ℃后延伸10 min.扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测.测序由上海铂尚生物工程技术服务有限公司完成.

将完成测序的菌株FJSC01序列提交至GenBank数据库获得序列号，并利用Blast搜索软件进行同源性分析.采用Seaview软件中的Muscle模型进行多序列比对分析，对序列的头尾进行修饰.将获得的FASTA格式文件在http://sing.ei.uvigo.es/ALTER/中使用Alignment Transformation Environment的Mrbayes模型转化为NEXUS格式.在CIPRES Science Gateway[16]运算平台(www.pholy.org)上进行大数据分析.使用MrBayes(3.2.6)on XSEDE[17]进行贝叶斯法(Bayesian inference, BI)分析；采用Figtree V1.4.3和Adobe Illustrator CS5在贝叶斯树上标注后验概率.

2 结果与分析

2.1 芽孢杆菌FJSC01对病原菌的拮抗效果

芽孢杆菌FJSC01对7种病原菌均有明显的抑制效果(表1、图1).其中，对青枯拉尔氏菌和胡萝卜软腐果胶杆菌的抑菌圈平均直径为(12.4±0.22)和(11.2±0.18) mm.

表1 菌株FJSC01对5种病原菌的抑制率1)Table 1 Inhibitory rates of strain FJSC01 on 5 pathogens

A.疫霉菌；B.胶孢炭疽菌；C.灰葡萄孢菌；D.立枯丝核菌；E.尖镰孢菌；F.胡萝卜软腐果胶杆菌；G.青枯拉尔氏菌.图1 菌株FJSC01对7种病原菌的抑制效果Fig.1 Inhibitory effects of strain FJSC01 on 7 pathogens

2.2 菌株FJSC01对烟草青枯病的防治效果

只接种清水的烟草植株生长正常，无任何发病症状(图2A)；只接种青枯菌时，烟草植株的平均发病率达100%，病情指数为93.8(表2)，植株完全萎蔫，维管束变褐且变空腔(图2B)；提前接种芽孢杆菌FJSC01后再接种青枯菌，植株发病率为75%，病情指数为62.5(表2)，植株延迟5 d发病，主要表现为下部叶片萎蔫,维管束变褐不明显(图2C).

A.阴性对照(只接种清水)；B.阳性对照(只接青枯菌)；C.先接种FJSC01再接种青枯菌.图2 芽孢杆菌FJSC01对烟草青枯病的室内防效Fig.2 Control effects of Bacillus FJSC01 on tobacco bacterial wilt in the laboratory

表2 芽孢杆菌FJSC01对烟草青枯病的室内防治率1)Table 2 Control rates of Bacillus FJSC01 on tobacco bacterial wilt in the laboratory

2.3 菌株FJSC01的鉴定

2.3.1 菌落和菌体形态特征 菌株FJSC01在NA培养基平板上生长的单菌落呈近圆形，湿润，微黄色，不透明，表面光滑，扁平，中部褶皱，边缘整齐(图3A).在光学显微镜下观察菌体FJSC01革兰氏染色为阳性，菌体为杆状，菌体中部有芽孢形态(图3B-C).

A.菌落；B.菌体革兰氏染色(标尺：5 μm)；C.菌体芽孢形态(标尺：5 μm).图3 菌株FJSC01菌落和菌体形态特征Fig.3 Colony and morphological characteristics of strain FJSC01

2.3.2 生理生化特征 菌株FJSC01能促使淀粉水解、硝酸盐还原、明胶液化、酪蛋白水解、纤维素分解，能利用柠檬酸盐，接触酶、V.P.试验呈阳性反应，尿素酶试验、甲基红试验、产氨试验呈阴性反应；不能产生黑色素、硫化氢、吲哚，可利用α乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、甘油、山梨醇、木糖.

2.3.3 16S rDNA序列分析 扩增菌株FJSC01的16S rDNA片段，产生一条1 500 bp左右的条带，测序、拼接得到该片段的核苷酸序列，全长为1 419 bp.在GenBank中提交序列，得到菌株FJSC01 16S rDNA片段的序列号为MF973065，该序列与已知的Bacillusmethylotrophicus16S rDNA序列相似性均在99%以上.用MrBayes构建菌株FJSC01与其相似性较高的20个菌株16S rDNA序列的系统进化树，结果发现，FJSC01与Bacillusmethylotrophicus16S rDNA的序列处于同一个分支(图4).

图4 基于菌株FJSC01和其他20个菌株16S rDNA序列构建的系统进化树Fig.4 The phylogenetic tree of strain FJSC01 and 20 strains of Bacillus spp. based on 16S rDNA sequences

综合形态特征、生理生化特征及16S rDNA分析结果，将FJSC01鉴定为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus).

3 讨论

本试验从作物根系分离到对烟草重要土传病原菌胡萝卜软腐果胶杆菌、青枯拉尔氏菌、尖镰孢菌等具有良好拮抗作用的芽孢杆菌FJSC01，通过形态特征、生理生化特征以及16S rDNA序列分析，将该菌株鉴定为甲基营养型芽孢杆菌.甲基营养型芽孢杆菌最早是由Madhaiyan et al[18]从水稻根系土壤中分离获得，并证明其对作物具有促生作用；随后该菌在多种生境中被分离到，并被发现具有良好的生防潜质.例如：冯云利等[19]发现甲基营养型芽孢杆菌是烤烟品种NC297内生细菌的优势种群，对烟草黑胫病菌有抑制作用；陈新春等[20]从蔬菜根际分离到的一株甲基营养型芽孢杆菌，对水稻白叶枯病菌、水稻细条病菌和尖孢镰刀菌均具有一定抑制作用；李祖红等[21]从水稻根际土壤中分离到的一株甲基营养型芽孢杆菌，对烟草疫霉菌有较好的抑制作用；周登博等[22]研究发现，甲基营养型芽孢杆菌4-L-16发酵液对香蕉枯萎病具有良好防效，可诱导苯丙氨酸解氨酶等4种抗病酶活性；此外，多项研究表明甲基营养型芽孢杆菌对青枯菌具有良好的抑制效果[23-25].本研究筛选的甲基营养型芽孢杆菌FJSC01对多种重要土传病原菌具有拮抗效果；盆栽接种试验表明，预先灌根FJSC01菌液可明显降低烟草青枯病的发生率与病情指数.但其田间防效还有待进一步研究.